棕櫚酸降低內皮型一氧化氮合酶Ser633位點磷酸化水平對內皮細胞功能影響的分子機制*

李小宇，梁政偉，秦思，張倩，張俊詩，丁菁，陸德琴*

(貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物防治研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；貴州醫科大學 基礎醫學院 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

由內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化產生的一氧化氮(nitric oxide，NO)是維持血管內皮功能的一個重要因子。eNOS酶活性調控機制中蛋白質翻譯后磷酸化修飾是重要機制之一，目前已知eNOS有Ser114、Thr495、Ser615、Ser633和Ser1177等5個絲/蘇氨酸磷酸化調控位點[1]，其中Ser633[2]和eNOS Ser1177[3]位點磷酸化增加均可增強eNOS活性。eNOS Ser1177磷酸化已被廣泛研究，其調控機制比較清楚[4]。eNOS Ser633可在細胞內鈣濃度不改變的條件下發生磷酸化且持續時間較eNOS Ser1177更長，因此可更有效地增強eNOS活性[5]。現有研究表明，蛋白激酶 A (PKA)、Pim1激酶、AMP 活化蛋白激酶 (AMPK)、細胞外信號調節激酶 (ERK) 1以及ERK2等蛋白激酶可使eNOS Ser633磷酸化而激活eNOS[5]，但對調控該位點去磷酸化的蛋白磷酸酶了解甚少。蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族包括蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)、PP2A、PP2B、PP2C以及PP5等[6]，PP2A又包含3個家族成員PP2A、PP4以及PP6，3者分子結構和酶學特性相似、氨基酸序列高度同源[7]，PP2A家族成員負責細胞內大多數蛋白質的Ser/Thr位點去磷酸化調控[8]。已經明確PP2A能直接使eNOS Ser1177去磷酸化[9]，PP2A激活后下調eNOS Ser1177磷酸化水平，降低細胞內NO含量，可導致內皮功能障礙[10-11]。然而，對于eNOS Ser633去磷酸化調控，迄今仍不清楚。游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs)，即非酯化脂肪酸，是體內的一種能源物質，當血漿FFAs異常升高會造成內皮功能損害[12-13]，誘導eNOS功能障礙，細胞凋亡增加，從而發生氧化應激和炎癥反應[14-15]。棕櫚酸(palmitic acid，PA)是一種飽和脂肪酸，是血液中含量最高的FFAs。已有研究報道，PA通過激活PP2A減少eNOS Ser1177磷酸化、降低eNOS活性以及細胞內NO含量[16]。本課題組前期研究發現PA還可激活PP2A家族中的PP4導致eNOS Ser633磷酸化水平降低，細胞內NO含量減少[17]，但具體分子機制尚不清楚。本研究將進一步驗證PA激活PP4下調eNOS Ser633磷酸化水平的作用，深入探討PA激活PP4的分子機制，旨在進一步闡明游離脂肪酸損害內皮功能的分子機制，并完善eNOS 磷酸化調控機制，為防治內皮功能障礙介導的心血管系統疾病提供新靶點、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，購自上海富衡生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器 凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)，電泳儀、轉膜儀(北京六一生物科技有限公司)，CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher 公司)，高速低溫離心機(美國Beckman Coulter 公司)，正置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(美國Thermo Fisher 公司)。

1.1.3主要藥物、試劑 PA、福司曲星(fostriecin，FST)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)以及夾竹桃素(apocynin，APO；美國Sigma公司)，3-氨基-5-氨基甲基-2′,7′-二熒光素二乙酸酯(DAF-FM DA；美國Med Chem Express)，2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA；中國南京建成公司)，鼠抗人eNOS和eNOS Ser633抗體(美國BD公司)，兔抗人PP4R2抗體和兔抗人PP4c抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，兔抗鼠PP2Ac抗體(美國Abcam公司)，兔抗鼠gp91phox抗體(美國Santa Cruz 公司)，抗β-tubulin抗體、HRP標記的羊抗鼠二抗以及HRP標記的羊抗兔二抗(武漢普美克生物技術有限公司)，特異性PP4c siRNA、特異性PP2Ac siRNA以及特異性gp91phox siRNA (中國上海吉瑪公司)，LipofectamineTM3000(美國Invitrogen公司)。PVDF膜(美國Millipore公司)，ECL化學發光液(天津天地人和生物科技有限公司)，BCA蛋白檢測試劑盒、RPMI 1640培養基(中國賽默飛世爾公司)，胎牛血清(FBS；以色列Biological Industries公司)，0.25%胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素(美國HyClone公司)，RIPA裂解緩沖液(中國Solarbio公司)，基質膠(美國康寧公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組 HUVECs用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5%CO2的加濕培養箱中進行培養，每2 d更換1次培養基。當細胞生長至約90%融合時，按1 ∶3比例傳代，取4～12代細胞進行實驗。將細胞分為Control組、PA處理組(分為25、50、100以及200 μmol/L PA處理36 h，100 μ mol/L PA處理12、24、36以及48 h)、FST預處理組、FST預處理+PA組、si-Control組、si-Control+PA組、si-PP2Ac組、si-PP4c組、si-PP2Ac+PA組、si-PP4c+PA組、Vector組、OE-PP4R2組、Vector+PA組、OE-PP4R2+PA組、NAC預處理組、APO預處理組、NAC預處理+PA組、APO預處理+PA組、si-gp91phox組及si-gp91phox組。

1.2.2配制 PA PA需在70 ℃溶解于0.1 mol/L NaOH中，先配制成60 mmol/L濃度，然后以1 ∶9比例用10%BSA稀釋，獲得6 mmol/L PA儲備液，過濾除菌后儲存于-20 ℃備用。

1.2.3PP4抑制劑和抗氧化劑預處理HUVECs 將PP4抑制劑FST和抗氧化劑NAC和APO分別溶于DMSO，-20 ℃保存。預處理HUVECs時終濃度分別選用FST為20 nmol/L、NAC為1mmol/L、APO為20 μmol/L，時間均為30 min。

1.2.4蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測eNOS總蛋白、eNOS Ser633、PP2Ac、PP4c、PP4R2、gp91phox蛋白質表達 于冰上用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，然后4 ℃，12 000 r/min離心25 min，收集上清液，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質通過10%的SDS-PAGE分離，轉移到PVDF膜上，并于室溫用5%脫脂牛奶封閉1 h后將膜與一抗在4 ℃孵育過夜。次日將PVDF膜用TBST洗3次，每次10 min，然后與二抗在室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，目的蛋白條帶用ECL液顯影。用凝膠成像系統中采集蛋白條帶圖片，Image J軟件進行條帶積分吸光度(A)值分析。結果以β-tubulin為內參照，以目的條帶與內參照條帶積分吸光度值的比值表示，至少重復3批次獨立實驗，每批次樣品重復檢測3次。

1.2.5一氧化氮(NO)的測定 用熒光探針DAF-FM DA進行細胞內NO產量測定，按說明書操作。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后，將熒光探針按1 ∶500比例稀釋到無血清和無酚紅培養基中，并加入細胞中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養30 min。使用奧林巴斯顯微鏡(IX71，日本)觀察熒光并拍照，熒光強度采用Image J軟件進行分析。

1.2.6活性氧(ROS)測定 用ROS熒光探針DCFH-DA檢測細胞內ROS含量，按照說明進行操作。將熒光探針按1 ∶2 000比例稀釋到無血清和無酚紅培養基中，加入到細胞中37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育30 min。用PBS清洗細胞3次，采用Olympus(IX71，日本)顯微鏡觀察熒光并拍照，熒光強度采用Image J軟件進行分析。

1.2.7siRNA轉染 特異性siRNA購自上海吉瑪公司。核苷酸序列如下：PP4c，正義鏈5′-GGACGAGCAUCUCCAGAAATT-3′，反義鏈 5′-CCUGCUCGUAGAGGUCUUUTT-3′；PP2Ac，正義鏈 5′-GAUACAAAUUACUUGUUUATT-3′，反義鏈 5′-UAAACAAGUAAUUUGUAUC-3′；gp91phox，正義鏈 5′-GGCUGUGCAUAAUAUAACATT-3′，反義鏈 5′-UGUUAUAUUAUGCACAGCCTT-3′。將HUVECs接種在6孔板中，當細胞密度達到40%～50%時進行轉染。根據LipofectamineTM 3000轉染試劑說明書，將PP4c siRNA、PP2Ac siRNA、gp91phox siRNA分別轉染至HUVECs；轉染6 h后，更換新鮮完全培養基，加或不加PA繼續培養36 h。

1.2.8慢病毒包裝、感染并獲得穩轉細胞株 pHJPLV-CMV-PP4R2-RFP-T2A-PURO慢病毒過表達PP4R2質粒由貴州禾晉生物公司提供。用293T細胞包裝慢病毒：將293T細胞接種于100 mm細胞培養皿中，待細胞密度達到50%～60%時更換無血清培養基培養1 h，然后按目的質粒 ∶pSPAX2質粒 ∶pMD2G質粒=4.4 μg ∶3.325 μg ∶2.225 μg比例加入150 μL DMEM培養基，混勻后室溫靜置5 min，同時取PEI 24 μL加入150 μL DMEM培養基，混勻，室溫靜置5 min后逐滴加入質粒混合液中，再混勻得到工作液，室溫靜置25 min；然后將工作液逐滴加入培養皿，混勻，37 ℃、5%CO2培養，6～8 h后換液繼續培養，72 h后收取病毒上清，3 000 r/min離心10 min，0.45 μm濾器過濾，直接感染HUVECs，同時感染空載病毒組作為對照。感染后72 h用倒置熒光顯微鏡觀察熒光情況，確定感染效率，并用嘌呤霉素篩選穩定株，得到PP4R2過表達穩轉HUVECs細胞株用于后續研究。

1.2.9細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 提前用標記筆于6孔板底部畫好橫線，將對數生長期的 HUVECs 接種于 6孔板 (每孔 5×105個細胞)，待細胞鋪滿培養皿融合成單層細胞后，用200μL槍頭在培養孔中沿橫線劃一條直線，用PBS清洗細胞2遍，加入含2%FBS培養基繼續培養。通過倒置顯微鏡觀察0、6、12以及24 h時細胞劃痕的愈合情況，并在各時間點分別隨機選擇6個100倍視野拍照，用Image J軟件進行分析，計算細胞遷移率，遷移率=(0 h距離-相應時間點距離)/0 h距離。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PA誘導eNOS Ser633磷酸化水平下調，減少細胞內NO生成

HUVECs分別用25、50、100及200 μmol/L PA處理36 h后，各組間eNOS蛋白總表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；但從50 μmol/L PA組開始eNOS Ser633磷酸化水平較Control組降低(P<0.05)，并呈濃度依賴效應。100 μ mol/L PA處理12、24、36以及48 h后，各組間eNOS蛋白總表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但從24 h開始eNOS Ser633磷酸化水平較Control組降低(P<0.05)，并呈時間依賴效應。后續實驗選擇100 μmol/L PA處理36 h作為干預條件，DAF-FM DA 熒光探針檢測細胞內NO產量，顯示PA組細胞產生NO減少(P<0.05)。見圖1。

注：A為不同PA濃度處理36 h對eNOS Ser633磷酸化水平的影響，B為蛋白水平相對表達量統計圖，C為100 μmol/L PA處理不同時間對eNOS Ser633磷酸化水平的影響，D為蛋白水平相對表達量統計圖，E為NO熒光表達水平，F為NO相對含量統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05。圖1 PA對HUVECs的eNOS Ser633磷酸化以及NO生成的影響Fig.1 Effect of PA on phospho-Ser633-eNOS level and NO production in HUVECs

2.2 PA通過激活PP4誘導eNOS Ser633磷酸化水平降低

Western blot結果顯示，FST預處理可抑制PA誘導eNOS Ser633磷酸化水平降低(P<0.05)，而eNOS總蛋白表達水平不受影響(P>0.05)。FST預處理后PA降低細胞內NO產量的作用也被抑制(P<0.05)。當敲低PP4c亞基后，eNOS Ser633磷酸化水平增加(P<0.05)。而敲低PP2Ac亞基對eNOS Ser633磷酸化水平無明顯影響(P>0.05)。各組eNOS總蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。上述結果提示，PA通過激活PP4(而不是PP2A)，下調eNOS Ser633磷酸化。見圖2。

2.3 PA通過降低 PP4R2 調節亞基蛋白表達水平激活PP4 導致 eNOS Ser633 磷酸化水平降低

Western blot檢測結果顯示，PA雖然不影響PP4催化亞基PP4c蛋白表達水平，但能抑制PP4調節亞基PP4R2的蛋白表達(P<0.05)。利用慢病毒過表達PP4R2質粒轉染HUVECs，特異性過表達PP4R2加以驗證，過表達PP4R2可逆轉PA誘導的eNOS Ser633的磷酸化水平降低(P<0.05)；且細胞內NO的含量明顯增加，內皮細胞遷移能力增加(P>0.05)。上述結果提示，PA通過抑制PP4R2調節亞基蛋白表達水平誘導PP4激活，從而降低eNOS Ser633磷酸化。細胞內NO產生減少，內皮細胞出現功能障礙。見圖3。

注：A為PP4抑制劑FST對 eNOS Ser633磷酸化水平的影響，B為蛋白水平相對表達量統計圖，C為PP4抑制劑FST對NO生成的影響，D為NO相對含量統計圖，E為敲低PP4c亞基對eNOS Ser633磷酸化水平的影響，F為蛋白水平相對表達量統計圖，G為敲低PP2Ac亞基對eNOS Ser633磷酸化水平的影響，H為蛋白水平相對表達量統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與PA組相比，P<0.05；(3)與si-Control組相比，P<0.05；(4)與si-PP4c組相比，P<0.05；(5)與si-Control+PA組相比，P<0.05； (6)與si-PP2Ac組相比，P<0.05。圖2 抑制PP2A、PP4活性以及敲低PP2Ac亞基、PP4c亞基對eNOS Ser633磷酸化水平以及NO產量的影響Fig.2 Effect of inhibiting PP2A and PP4 activity as well as knockdown of PP2Ac and PP4c on phospho-Ser633-eNOS level and NO production

注：A為PA對PP4c亞基和PP4R2亞基蛋白表達水平影響，B為蛋白水平相對表達量統計圖；C為成功感染慢病毒過表達PP4R2質粒，D過表達PP4R2蛋白對eNOS Ser633的磷酸化水平影響，E為蛋白水平相對表達量統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與Vector組相比，P<0.05；(3)與OE-PP4R2組相比，P<0.05；(4)與Vector+PA組相比，P<0.05。圖3 過表達PP4R2亞基對eNOS Ser633磷酸化的影響Fig.3 The effect of PP4R2 subunit overexpression on on eNOS Ser633 phosphorylation

2.4 過表達PP4R2調節亞基蛋白改善 PA對HUVEC細胞功能的抑制作用

DAF-FM DA 熒光探針檢測細胞內NO產量，結果顯示PA組細胞產生NO減少(P<0.05)，OE-PP4R2+PA組細胞產生NO顯著增加(P<0.05)。細胞劃痕實驗觀察過表達PP4R2調節亞基蛋白對PA刺激HUVEC的遷移能力的影響，結果顯示過PA組內皮細胞遷移能力被抑制(P<0.05)，而OE-PP4R2+PA組細胞遷移能力較PA組顯著增強。見圖4。

注：A為過表達PP4R2蛋白對細胞內NO生成影響，B為NO相對含量統計圖；C為過表達PP4R2蛋白對細胞遷移能力影響，D為細胞劃痕6 h的遷移率統計圖，E為細胞劃痕12 h的遷移率統計圖，F為細胞劃痕24 h的遷移率統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與Vector組相比，P<0.05；(3)與OE-PP4R2組相比，P<0.05;(4)與Vector+PA組相比，P<0.05。圖4 過表達PP4R2亞基對NO生產以及細胞遷移功能的影響Fig.4 The effect of PP4R2 subunit overexpression on NO production and cell migration function

2.5 PA通過 Nox/ROS 通路降低 PP4R2 蛋白水平,繼而下調 eNOS Ser633 磷酸化水平

通過 Westem Blot 檢測 NADPH 氧化酵但化亞基gp91phox,結果發現 PA 增加 gp9lphox 的蛋白表達(P<0.05)。使用抗氧化劑NAC(1 mmoVL 或 20 μmo/L)APO 預處理 HU-VECs,結果顯示 PA 處理后 ROS 含量高于 Control組(P<0.05),NAC 或 APO 預處理后 ROS 含量降低(P<0.05)。Western Blot 結果表明,NAC 或 APO 預處理均可復 PP4R2 蛋白表達水平以及 eNOS Se633 磷酸化水平(P<005)但不影響各組間 PP4e 亞基蛋白表達水平。特異性 siRNA 低 gp9lphox 亞基后可逆轉 PA 誘導的 PP4R2 蛋白表達水平降低及eNOS Ser633 磷酸化水平下降(P<0.05),但不影響 PPc 亞基蛋白表達水平。上述結果表明,PA 可能通過 Nox/ROS 通路降低 PP4R2 蛋白表達水平，從而激活 PP4,降低 eNOS Ser633 磷酸化水平。見圖5、圖6。

注：A為PA對Nox催化亞基gp91phox蛋白表達的影響，B為蛋白水平相對表達量統計圖，C為NAC和APO對PA刺激后細胞內ROS產量的影響，D為ROS相對含量統計圖，E為NAC對 PA刺激后PP4R2亞基蛋白表達以及eNOS Ser633磷酸化水平的影響，F為蛋白水平相對表達量統計圖，G為APO對 PA刺激后PP4R2亞基蛋白表達以及eNOS Ser633磷酸化水平的影響，H為蛋白水平相對表達量統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與PA組相比，P<0.05。圖5 Nox/ROS通路對PA降低PP4R2亞基蛋白表達水平以及eNOS Ser633磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of the Nox/ROS pathway on PA-mediated decrease of PP4R2 protein expression and phospho-Ser633-eNOS levels

注：A為敲低gp91phox對eNOS Ser633磷酸化水平、PP4R2亞基以及PP4c亞基蛋白表達的影響，B為蛋白水平相對表達量統計圖；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與PA組相比，P<0.05；(3)與si-Control組相比，P<0.05；(4)與si-gp91phox組相比，P<0.05。圖6 Nox對PA降低PP4R2亞基蛋白表達水平及eNOS Ser633磷酸化水平的影響Fig.6 Effect of the Nox on PA-mediated decrease of PP4R2 protein expression and phospho-Ser633-eNOS levels

3 討論

內皮功能障礙的重要表現之一是eNOS酶活性降低、內皮細胞產生NO減少。eNOS酶活性可在轉錄水平、翻譯水平、翻譯后水平進行調控，翻譯后的調控機制中蛋白磷酸化修飾是其中一個重要方式，eNOS Ser633和eNOS Ser1177是可增強eNOS活性的兩個重要的磷酸化調控絲氨酸位點[18-19]。eNOS Ser1177磷酸化快速且依賴于鈣，已被公認是eNOS激活的主要原因之一。有研究認為，eNOS Ser633是eNOS Ser1177發生早期磷酸化后，在不依賴細胞內鈣水平的情況下持續維持eNOS活性，持續增加NO產量的主要原因[20-21]。目前關于eNOS Ser1177磷酸化調控的研究報道較多，而eNOS Ser633磷酸化調控機制研究報道較少，尤其是其去磷酸化調控機制尚未見報道，本研究將進一步揭示eNOS Ser633去磷酸化調控機制，對進一步闡明內皮功能及其功能障礙分子機制具有顯著的病理生理學意義。

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶在細胞內調控絕大多數蛋白質的去磷酸化過程，其中 90%的絲氨酸和蘇氨酸的去磷酸化歸因于 PP1和PP2A[22]。PP2A在eNOS的磷酸化調節中起著重要作用，PP2A亞家族包含3個主要成員，PP2A、PP4及PP6。已有研究表明PA可激活PP2A，下調eNOS Ser1177磷酸化水平，降低NO產生[16,23]。本課題組前期研究發現PA還可激活PP2A家族中的PP4，而不是PP2A導致eNOS Ser633磷酸化水平降低及細胞內NO產量減少的[17]。PA如何激活PP4，抑制PP4是否可恢復eNOS Ser633磷酸化水平從而恢復內皮細胞功能，本研究開展了深入探討。

PP4和PP2A有65%的氨基酸序列同源性，對外源性抑制劑福司曲星(fostriecin，FST)敏感[24-25]。因此，首先選用PP4抑制劑FST預處理HUVECs，結果FST可逆轉PA誘導的eNOS Ser633磷酸化水平降低和細胞內NO產量減少。其次再運用PP2A催化亞基(PP2Ac)特異性siRNA或PP4催化亞基(PP4c)特異性siRNA轉染HUVECs，結果顯示，敲低PP2Ac后eNOS Ser633的磷酸化水平無明變化，但敲低PP4c可明顯增加eNOS Ser633磷酸化水平。這與本課題組既往報道結果一致[17]。為進一步探討PA激活PP4的分子機制，運用Western blot方法檢測PP4調節亞基PP4R2蛋白表達水平，發現PA顯著下調eNOS Ser633磷酸化水平的同時PP4R2蛋白表達水平顯著降低。據研究報道，PP4R2是PP4的活性調節亞基，與PP4結合形成聚合體，可負性調控PP4活性[26]。為進一步證實PP4R2調控PP4活性從而調控eNOS Ser633磷酸化水平和內皮細胞功能的作用，本研究構建了慢病毒PP4R2過表達質粒，并轉染至HUVECs。結果顯示，過表達PP4R2可逆轉PA下調的eNOS Ser633磷酸化水平，過表達PP4R2逆轉了由PA引起的NO生成降低，恢復內皮細胞遷移能力。已知PA是引起細胞氧化應激的常見因素，因而推測NADPH氧化酶(NAPDH oxidase，Nox)/ROS通路可能參與了PA抑制PP4R2蛋白表達調控。為了證實Nox/ROS通路的作用，首先觀察到PA有提高Nox催化亞基gp91phox蛋白表達水平及增加細胞內ROS含量的作用。其次，選用抗氧化劑NAC和APO分別預處理HUVECs，觀察到PA誘導的PP4R2蛋白表達降低和eNOS Ser633磷酸化水平降低均明顯得到恢復。然后進一步采用gp91phox特異性siRNA轉染HUVECs加以證實，結果表明抑制Nox催化亞基gp91phox，可明顯逆轉PA誘導的PP4R2蛋白表達降低和eNOS Ser633磷酸化水平降低。以上結果表明，PA可通過Nox/ROS通路降低PP4的負性調控亞基PP4R2蛋白表達水平，導致PP4激活，后者可引起eNOS Ser633磷酸化水平降低。

綜上所述，游離脂肪酸中最常見的PA可通過增強內皮細胞中Nox催化亞基gp91phox蛋白表達，使Nox酶活性增強，細胞內ROS產量增加，細胞內出現氧化應激反應，抑制PP4的負性調控亞基PP4R2蛋白質表達，導致PP4激活，PP4進而降低eNOS Ser633磷酸化水平，eNOS酶活性降低，內皮細胞產生NO，發生內皮功能障礙。PP4R2蛋白表達被抑制的分子機制以及PP4降低eNOS Ser633磷酸化水平是直接作用還是間接作用還需進一步深入研究。