酶聯免疫捕獲法檢測耳鼻喉科患兒血清過敏原特異性IgE的價值

陳昕誼 彭東正

變態反應性疾病的診斷是治療的依據。對普通的吸入性變應原，根據臨床病史，結合皮膚測試和（或）過敏原特異性IgE（specific immunoglobulin E，sIgE）的測定，可以作出特異的變應原診斷[1]。sIgE 法是一種安全的檢測指標，它不受患者的皮膚狀況、藥物使用歷史的影響，能檢出多種變態反應原，并在臨床上得到廣泛的應用[2]。長期以來，在臨床上很少有可用于 sIgE 的定量測定，目前國內只有 Immuno CAP 系統。本系統應用熒光酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術，是目前世界上對變應原sIgE 的“金標準”[3]。但是，由于采用的是進口設備，價格昂貴，難以在我國大規模推廣。酶聯免疫捕獲法是一種全自動的全定量的變應原免疫吸附檢測系統，它與傳統的固相包被致敏原不同，它首先將血清中的 IgE 抗體被包覆于固相載體上的抗IgE 抗體捕獲，在此基礎上，添加了液相的變應原，以消除非 IgE 抗體的干擾，提高了檢測的敏感性[4]。本研究選取廣州市中西醫結合醫院2019 年3 月—2022 年2 月收治的耳鼻喉科患兒血清樣本300 份，旨在探討酶聯免疫捕獲法檢測對耳鼻喉科患兒血清過敏原特異性IgE（sIgE）水平分析的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月—2022 年2 月廣州市中西醫結合醫院收治的耳鼻喉科患兒300 例，納入標準：（1）于本院耳鼻喉科就診，且需進行過血液生化檢驗。（2）臨床資料完整。（3）年齡≤18 周歲。排除標準：（1）入組前1 周有免疫抑制劑應用史。（2）因精神疾病或其他原因無法配合完成。本研究經醫院倫理委員會審批，批準免除知情同意（批號20220132）。取患兒臨床血液生化檢驗剩余血清進行過敏原特異性IgE 檢測。基本資料中，患兒年齡2 ～18 歲，平均（11.5±2.4）歲。病程0.5 ～5 年，平均（2.3±0.4）年。

1.2 方法

取已知粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢sIgE 抗體陽性血清高、中、低濃度各3 份，每份200μL，分裝好后保存在-20℃冷凍，用前復溶。樣品稀釋液則不含任何過敏原的sIgE 抗體，保存在2 ～8 ℃冷藏。另取前述患者血清樣本300 份，保存在2 ～8 ℃冷藏待用。

分別使用酶聯免疫捕獲法和Immuno CAP 系統對sIgE水平進行檢驗。其中，酶聯免疫捕獲法sIgE 抗體檢測試劑盒購自蘇州浩歐博生物醫藥有限公司，廣州市中西醫結合醫院檢驗科全自動酶免儀則由深圳愛康生物科技有限公司生產。Immuno CAP 系統則由瑞典Phadia AB 公司生產的試劑盒以及全自動熒光免疫分析儀組成。相關操作均嚴格按照產品說明書進行。

1.3 觀察指標

比較兩種系統檢驗sIgE 水平的精密度、靈敏度、線性范圍，并進行方法學對比。其中，精密度評價依據CLSIEPl5-A2 文件進行[5]，酶聯免疫捕獲法檢測對血清樣本上述過敏原sIgE 分別檢測，4 次/d，連續5 d，計算批內變異系數（coefficient of variation，CV）以及總CV%。靈敏度評價則對稀釋液樣本進行上述過敏原sIgE 分別檢測，同一批內進行連續20 次測定，得到吸光度平均值以及標準差結果，使用定標曲線方程計算定量下限（limit of quantitation，LOQ）。線性范圍評價則依據張秀明的方法進行[6]，2 種方法對血清樣本的過敏原sIgE 檢測后，使用線性回歸對定量結果進行分析，依照國際慣例，0.35 kU/L 作為結果閾值，小于該結果則判定為陰性，大于等于該結果則判定為陽性[5]。使用Kappa 分析對定性結果進行評價，同樣依照上述國際標準。

1.4 統計學方法

研究數據全部導入SPSS 20.0 統計學軟件包進行整理和分析，計量資料以（±s）表示，進行t檢驗；計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗。定量數據使用線性回歸分析，定性數據使用Kappa 一致性分析，以α=0.05 為檢驗標準，Kappa 分析標準為0.75。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精密度比較

酶聯免疫捕獲法檢測6 種過敏原sIgE 的批內CV 值均＜7%，而總CV%＜8%，根據產品說明書，以上指標均低于不精密度標準，酶聯免疫捕獲法檢測的精密度可滿足臨床應用。見表1。

表1 酶聯免疫捕獲法檢測的精密度

2.2 靈敏度比較

6 種過敏原的LOQ 值均＜0.35 KU/L，均為陰性。見表2。

表2 酶聯免疫捕獲法檢測的靈敏度（%）

2.3 線性范圍比較

粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢的樣品范圍濃度依次分別為：0.37 ～94.34 kU/L，0.35 ～89.43 kU/L，0.36 ～91.23 kU/L，0.35 ～93.35 kU/L，0.33 ～95.32 kU/L，0.36 ～85.64 kU/L，檢測結果均無明顯離群值。粉塵螨的相關系數為0.998，戶塵螨的相關系數為0.999，狗毛屑的相關系數為0.986，貓毛屑的相關系數為0.991，艾蒿花粉的相關系數為0.990，鏈格孢的相關系數為0.989，均大于產品說明書的閾值0.975，線性范圍良好。

2.4 兩種檢測方法比較

2.4.1 定量結果比較

不同過敏原的回歸方程斜率差異均有統計學意義（P＜0.05），兩系統定量檢測結果相關性較強。見表3。

表3 兩種檢測方法定量結果比較

2.4.2 定性結果比較

兩種檢測方法的定性結果顯示，陽性符合率均低于90%，其中以粉塵螨的陽性符合率最高，為86.00%，粉塵螨、貓毛屑和艾蒿花粉的陰性符合率并列第一，均為100%。綜合來看，兩種檢測方法的陽性符合率為77.33%，陰性符合率為98.67%，Kappa 值為0.833，P＜0.05。見表4。

表4 兩種檢測方法定性結果比較

3 討論

IgE 是一種特異的變應原診斷指標。長期以來，我國對過敏性原 sIgE 的測定大都是半定量的，不僅不能全面、準確地給出準確的診斷結果，而且大部分都是人工進行的；由于難以進行品質控制，難以確保試驗結果的準確性和可靠性[7]。Immuno CAP 是目前世界上對過敏性原 sIgE 定量測定的“金標準”，國內20 多年前就引進了 Immuno CAP，本系統應用ELISA 技術，是目前世界上對變應原sIgE 的“金標準”。但是，由于采用的是進口設備，價格昂貴，難以在我國大規模推廣。因此，在臨床上，急需一種低成本的全自動定量分析方法[8]。酶聯免疫捕獲法是一種能夠國產的全自動、全定量變應性 IgE 檢測系統，同樣采用 ELISA 技術，與傳統的固相包被致過敏原不同，它首先將血清中的 IgE抗體被包覆于固相載體上的抗IgE 抗體捕獲，在此基礎上，添加了液相的變應原，以消除非 IgE 抗體的干擾，提高了檢測的敏感性，以微孔板為固相載體，將抗人 IgE抗體引入到受檢者的體內；充分捕獲檢測血清中 IgE 抗體，清除游離抗體，如 IgG，防止其他抗體與變應原發生競爭；然后，在液體中添加生物素變態反應源，將其與固定載體上的 sIgE 結合，形成“抗人IgE-sIgE-過敏原”這類免疫復合物，最后添加到鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶，并與底物進行顯色反應。結果表明，樣品中 sIgE 水平較高[9]。采用捕捉技術，不僅能有效地消除非 IgE 的干擾，而且能減少變態反應的用量，降低試劑的費用；利用生物素親和素體系，可以有效地提高檢測的敏感性[10]。

本研究對酶聯免疫捕獲法的性能進行了初步評價。對于6 種常見吸入物過敏原，低、中、高值樣本的批內和總CV%均低于試劑盒標示不精密度。各種過敏原的定量測定下限不等，但均低于分析下限0.35 kU/L，符合廠商標示靈敏度。粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢過敏原的相關系數均大于0.975，說明線性范圍良好。

國際上對 sIgE 的定性標準是0.35 kU/L，在此數值以下時敏感性高于90%，但特異性卻相對較低[11]。血清中 sIgE值＞0.35 kU/L，說明患者對變應原的耐受性降低，暴露于變應原的發生率也會增加。本研究結果表明，6 個變應原的陰性符合率均大于陽性符合率，其中粉塵螨、貓毛屑和艾蒿花粉的陰性符合率并列第一，均為100%。陽性符合率粉塵螨最高，為86.00%；狗毛屑最低，為58.00%。

以上結果表明，Immuno CAP 與酶聯免疫捕獲法的預測值具有較好的相關性，但也存在一些差異。國外也有一些關于不同檢測體系的 sIgE 測試結果的一致性，分析表明，主要是因過敏原原料的差異引起的[12]。過敏原的主要成分是過敏性提取物，主要由各種致敏性的蛋白質組成。筆者認為，在過敏原的選用上以主要致敏蛋白為主，其次是次要致敏蛋白；所有敏感蛋白均無組分丟失，并以合適的濃度保證了所有過敏患者的檢測，并且量化的結果具備一定的臨床相關性[13]。但由于植物、動物、微生物等來源因素的影響，其致敏性成分的含量和活性也因地理位置的不同與自然環境的改變而發生改變。目前，國內尚無完全變態反應原的標準，所有的原材料及診斷試劑制造商，均依靠自己的實驗室對照品來進行品質管理。因此，不同的過敏原sIgE 檢測體系難以取得完全一致的結果，需要臨床醫生對自己的測試體系有足夠的認識，并根據臨床情況做出適當的解釋[14-15]。

綜上所述，酶聯免疫捕獲法檢測對耳鼻喉科患兒血清過敏原特異性IgE 水平的評價效能，具有較好的精密度與靈敏度，且與Immuno CAP 系統的相關性較好，作為一種自動化全定量檢測手段，能夠滿足臨床耳鼻喉科常見過敏原檢驗的要求，具有使用價值。此文的研究結果為兒童耳鼻喉科常見過敏性疾病的診斷和鑒別診斷后期標準制定提供了借鑒內容。