RASAL2基因高甲基化與宮頸鱗癌患者放化療敏感性的研究

劉金輝，方亞妮，劉 孜，李 翡

(1.陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西咸陽 712046；2.西安交通大學第一附屬醫院腫瘤放療科，西安 710061；3.陜西中醫藥大學婦科教研室，陜西咸陽 712046)

宮頸癌是全球范圍常見的女性惡性腫瘤之一，按照病理類型主要分為鱗狀細胞癌和腺細胞癌兩種，前者占80%以上[1-2]。臨床通常將ⅠB2～ⅣA期的宮頸癌統稱為局部晚期宮頸癌(locally advanced cervical cancer,LACC)。目前，順鉑聯合放療的同步放化療(concurrent chemo-radiotherapy，CCRT)是LACC患者的主要治療手段[3]。雖然CCRT明顯改善了患者的總體生存情況，并降低了腫瘤復發率[4]，但仍有部分患者無法從治療中受益，急需進一步闡明其分子機制[5]。

類RAS基因激活物2(ras protein activator like 2,RASAL2)基因編碼的產物為一種RAS-GTPase激活蛋白，催化RAS-GTP水解為RAS-GDP，進而抑制Ras基因活性[6]。研究顯示，RASAL2基因在Luminal B型乳腺癌發揮抑癌基因作用[7-8]，但在部分三陰性乳腺癌中則是扮演著致癌基因的角色[9]。此外，RASAL2基因啟動子區在肝細胞癌組織中普遍呈超低甲基化狀態，而下調該基因可明顯抑制肝癌細胞生長和侵襲[10]。這些有爭議的結果表明，RASAL2基因在惡性腫瘤的發生、發展中扮演著不同的角色[11]。RAS基因突變存在于多種類型惡性腫瘤中，但在宮頸鱗癌中發生率很低[12]。然而也有研究證實，K-RAS及H-RAS基因在宮頸癌組織中的表達水平明顯高于正常宮頸組織，且參與了腫瘤的發生和轉移[13]，表明RAS基因在宮頸鱗癌中可能依賴其他機制激活，而并非依賴于獲得性突變。因此，探索RASAL2基因在宮頸鱗癌中的狀態，有助于進一步闡明宮頸鱗癌發生發展的機制，并為其臨床治療提供潛在的靶點。

本文研究了RASAL2基因在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的甲基化和表達水平，發現在宮頸鱗癌組織中，RASAL2基因呈現為異常高甲基化和表達下調狀態，同時，RASAL2基因甲基化狀態與腫瘤細胞分化程度及患者對CCRT的應答呈相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年9月至2019年9月西安交通大學第一附屬醫院接受CCRT治療的60例宮頸鱗癌患者標本。納入標準：(1)經組織病理學確診為宮頸鱗癌；(2)保存有足夠的活檢組織標本；(3)隨訪時間≥1年。排除標準：(1)活檢取標本前已接受化療、放療等治療；(2)同時患有≥2種惡性腫瘤。收集同期就診的10例卵巢癌患者的正常宮頸組織，經組織病理學檢測確定未發生病變。本研究經西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會審批通過，患者均簽署知情通知書。

1.2 方法

1.2.1分組

60例宮頸鱗癌患者均接受CCRT，其中放療包括外放射治療(external beam radiation therapy,EBRT)和隨后進行的近距離局部高劑量腔內放射治療(high-dose rate intracavitary brachytherapy,HDR-ICBT)。EBRT實施于整個盆腔，總照射劑量為50 Gy，每周進行5次，每次2 Gy，共25～28次。HDR-ICBT照射劑量在25 Gy左右，每周進行2次，共4～5次。進行EBRT的患者同時接受順鉑治療，劑量為25 mg/m2，靜脈滴注給藥，每周1次，化療5個周期。患者治療前后均進行婦科檢查，B超或CT檢測，治療周期結束后根據實體瘤治療應答評價標準(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)[14]評估臨床應答情況，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩定(stable disease，SD)和疾病進展(progressive disease，PD)，其中CR患者歸為敏感組，PR、SD和PD患者歸為耐受組。

1.2.2主要試劑

DNA提取試劑盒QIAmp DNA mini試劑盒和重亞硫酸鹽處理試劑盒EpiTect Bisulfite Kit 購自美國Qiagen公司，甲基化和表達引物購自上海生工生物工程有限公司，ResoLight染料購自瑞士Roche公司，HiTaq HS聚合酶購自深圳菲鵬生物科技有限公司，組織蛋白質裂解液(C500028)購自上海生工生物工程有限公司，兔抗人RASAL2抗體(ab121578)購自英國Abcam公司。

1.2.3DNA提取和重亞硫酸鹽處理

采用QIAmp DNA mini試劑盒提取和純化DNA，實驗步驟按說明書進行，標本統一洗脫體積為40 μL。DNA經NanoDrop2000定量后，Tris-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液統一稀釋至100 ng/μL。進行甲基化特異性定量檢測(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)反應前對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理。重亞硫酸鹽可使未發生甲基化的C脫氨形成U，而對發生甲基化的C不起作用。因此，針對CpG設計的甲基化特異性引物，相應的堿基序列仍為C。本研究采用EpiTect Bisulfite 試劑盒對待測標本DNA進行重亞硫酸鹽處理，各標本的DNA轉化起始量均為1 μg。

1.2.4qMSP

qMSP通過在基礎PCR反應體系中加入雙鏈核酸染料實現。采用相對定量方式分析RASAL2基因甲基化程度，選取膠原Ⅱα1(collagen type Ⅱ Alpha 1，COL2A1)作為內參基因，其擴增引物針對該基因非CpG位點序列設計。qMSP過程采用25 μL反應體系，每個反應體系中加入0.25 μL ResoLight染料，0.5 U HiTaq HS聚合酶，引物250 nmol/L及20 ng重亞硫酸氫鹽處理過的DNA。所有qMSP反應均在ABI ViiATM7實時PCR平臺上進行。反應程序：95 ℃變性10 min；隨后運行40個循環擴增程序；95 ℃變性15 s，Tm退火20 s，72 ℃延伸20 s。反應完成后，根據ViiATM7軟件給出的Ct值對RASAL2基因進行甲基化相對定量分析。使用2—ΔΔCt計算RASAL2基因相對甲基化率，其中ΔCt指同一標本RASAL2基因Ct與內參基因Ct的差值。如果樣品內部控制反應失敗，則棄用該標本數據。

1.2.5蛋白提取和定量

提取標本總蛋白，使用NanoDrop2000進行定量。蛋白標本上樣量為50 μg，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進行電泳；轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入RASAL2一抗(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后使用二抗(1∶3 000)于室溫孵育4 h。基于Syngene化學發光成像系統拍照并依據Image J進行灰度分析，進行RASAL2蛋白定量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 患者臨床信息

60例患者均可評價療效，其中敏感組(CR)32例、耐受組(PR 21例、PD 7例)28例，兩組年齡、腫瘤大小、病理類型、國際婦產科學會(Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期(2009年標準)等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較[n(%)]

2.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織RASAL2基因甲基化狀態

qMSP結果顯示，宮頸癌組織RASAL2基因甲基化水平較正常組織明顯升高(0.317±0.029vs. 0.174±0.078，P=0.020)，耐受組高于敏感組(0.400±0.040vs. 0.244±0.036，P=0.003)，見圖1。

A：宮頸癌組織和正常宮頸組織比較；B：敏感組、耐受組和正常宮頸組織比較；a：P<0.05。圖1 宮頸癌組織及正常宮頸組織RASAL2基因甲基化狀態

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織RASAL2基因的表達水平

敏感組(0.184±0.014)和耐受組(0.131±0.010)RASAL2基因表達水平均低于正常組(0.307±0.048)，且耐受組低于敏感組，差異有統計學意義(P=0.006)。相關性分析顯示，宮頸癌組織RASAL2基因表達水平與RASAL2甲基化程度呈負相關(r=-0.665，P<0.001)，見圖2。

A：敏感組、耐受組和正常宮頸組織RASAL2基因表達情況比較；B：宮頸癌組織RASAL2基因表達水平與RASAL2甲基化程度相關性；a：P<0.05。圖2 宮頸癌和正常組織RASAL2基因表達情況

2.4 RASAL2基因甲基化與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

中高分化腫瘤組織RASAL2基因甲基化水平低于低分化腫瘤組織RASAL2基因甲基化水平(0.023±0.003vs. 0.045±0.005)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

aP<0.001。圖3 RASAL2基因高甲基化與晚期宮頸癌細胞分化程度相關

2.5 RASAL2基因甲基化與宮頸癌患者CCRT敏感性的關聯分析

單因素logistic回歸分析結果顯示，RASAL2基因甲基化水平可作為預測宮頸癌患者CCRT敏感性的因子(P<0.05)，RASAL2基因高甲基化患者的臨床應答率明顯低于該基因低甲基化患者，見表2。

表2 單因素logistics回歸分析結果

3 討 論

啟動子區高甲基化是基因沉默的重要機制，是宮頸癌中常見的分子事件[15]，但目前甲基化分子標志物與宮頸癌患者臨床應答的相關研究進展緩慢。YE等[16]進行的一項研究表明，TP73蛋白水平與宮頸癌患者的放療敏感性呈現出相關性，表現為TP73基因表達水平高的患者對放療更為敏感。該項研究進一步證實，TP73基因啟動子區甲基化水平與該蛋白表達水平呈負相關，且去甲基化試劑處理可使宮頸癌細胞系TP73基因表達明顯上調，表明高甲基化是引起該基因沉默的原因。另一項研究發現，FANCF基因啟動子高甲基化在宮頸癌細胞中十分普遍，且高甲基化使得細胞對多種可造成DNA損傷的藥物異常敏感[17]。而最近的一項研究表明，FANCF基因去甲基化會引起卵巢癌細胞對順鉑的不敏感[18]。由此可推測，FANCF基因啟動子高甲基化可增強宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，但仍需進一步證實。此外，細胞凋亡信號通路DAPK及FAS基因甲基化水平被證實與宮頸癌患者接受CCRT的敏感性明顯相關[19]。本研究分析了60例宮頸鱗癌患者的RASAL2基因甲基化和表達情況，以及這些變化與患者臨床病理特征、臨床應答的關聯性，證實RASAL2基因甲基化可作為預測患者CCRT敏感性的標志物。

RASAL2基因啟動子甲基化和表達缺失在Luminal B型乳腺癌普遍存在，而正常功能的RASAL2基因可有效抑制該類腫瘤的發生和轉移[7-8]。然而，在肝細胞癌組織中，RASAL2基因啟動子卻呈現為低甲基化狀態，且RASAL2基因缺失可有效抑制癌細胞的生長和侵襲能力[10]。基于qMSP實驗結果，證實腫瘤標本中RASAL2基因甲基化水平較正常宮頸組織明顯上調，且甲基化程度在低分化腫瘤細胞中最高。此外，在腫瘤標本中檢測到RASAL2基因表達的缺失，且與甲基化水平呈負相關。這些結果證實，RASAL2基因轉錄沉默與異常啟動子甲基化有關，且后者參與了宮頸癌的發生、發展。另外，在部分正常組織中也檢測到了RASAL2基因甲基化的存在，雖然不能排除一些組織標本被鄰近的腫瘤細胞污染的可能性，但既往的研究表明，導致這種情況產生的原因很可能是“正常組織”實際已產生了癌前病變[20]。而深入解決這個問題，需要更大樣本量開展研究。

值得注意的是，耐受組RASAL2基因甲基化水平明顯高于敏感組，且RASAL2基因高甲基化可作為獨立預測患者不良應答的因子。結合其他研究成果，有理由認為RASAL2基因在宮頸鱗癌細胞中發揮著抑制RAS基因活性的生物學功能。低甲基化時，正常表達的RASAL2基因可有效抑制宮頸癌細胞的RAS基因活性，進而一定程度上抑制了腫瘤細胞的遷移、侵襲和克隆形成能力；相應地，高甲基化誘導的RASAL2基因表達缺失會失去對Ras基因的抑制作用，給腫瘤細胞的生長和增殖提供環境，進而為放化療后殘存的腫瘤細胞帶來生存和種群再生的優勢，臨床表現為患者對CCRT不敏感。RASAL2基因影響宮頸癌患者CCRT敏感性的具體分子機制有待進一步闡明。

綜上所述，RASAL2基因異常甲基化和低表達在宮頸癌發生、發展過程中起著重要作用。與遺傳改變不同，表觀遺傳改變是可逆的，這使得它成為一個有吸引力的治療目標，后續研究需要闡明RASAL2基因去甲基化在宮頸癌臨床治療中的可行性。