蘇木及其活性成分對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制作用研究

徐令清，杜良琴，袁潤(rùn)奇，晏 嘉，陳 旋，簡(jiǎn)永歡，周飄雁，溫偉洪，李林海

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 廣東清遠(yuǎn) 511518)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種需氧非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界及人體皮膚，為臨床常見(jiàn)的條件致病菌[1]。由于其生存能力強(qiáng)，并且存在多種耐藥機(jī)制，常常有多重耐藥的特性，而這種多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌[2-3]。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物曾被認(rèn)為是抗菌活性最強(qiáng)的內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物,但隨著此類(lèi)藥物的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性日益增強(qiáng)，故臨床對(duì)此類(lèi)細(xì)菌面臨無(wú)藥可用的窘境。蘇木作為傳統(tǒng)天然中藥，具有廣泛的生物活性。有研究表明，蘇木中成分巴西蘇木素對(duì)各類(lèi)微生物都有抑制作用[4-6]，但對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRABA)的抑菌作用國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)體外試驗(yàn)探究巴西蘇木素對(duì)CRABA的抑制作用及其機(jī)制，并將巴西蘇木素與美羅培南進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)觀(guān)察其抑菌作用，為中藥治療CRABA感染提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1菌株來(lái)源

收集2020年本院檢驗(yàn)科微生物室分離的10株CRABA，其中5株來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)室，2株來(lái)源于急診科，3株來(lái)源于其他科室。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)任何一種碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥判定為CRABA株。質(zhì)控菌株為：美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)25922大腸埃希菌(Escherichia coli，ECO)；ATCC 25923金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SAU)。

1.1.2試劑與儀器

蘇木(康美藥業(yè)股份有限公司)；蘇木單體：巴西蘇木素，原蘇木素B(成都曼斯特生物科技有限公司)；美羅培南(北京索萊寶科技有限公司)；血平板(江門(mén)市凱林貿(mào)易有限公司)；肉湯培養(yǎng)基與MH瓊脂平板(廣州市迪景生物科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；DHP-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；uLtiMate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；SPECTROstar Nano全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司)。

1.2 方法

1.2.1藥物敏感試驗(yàn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)所有標(biāo)本均按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》及本實(shí)驗(yàn)室的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行接種和培養(yǎng)，菌株分離純化后使用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)，按2020年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行敏感性判斷。

1.2.2蘇木抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1蘇木萃取液、巴西蘇木素和原蘇木素B溶液制備

稱(chēng)量蘇木100 g放于離心管中與無(wú)水乙醇200 mL以1∶2的比例混勻，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩48 h然后離心，4 500 r/min離心5 min，取離心管稱(chēng)量并標(biāo)記序號(hào)，取上清液于離心管中，開(kāi)蓋放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中50 ℃震蕩24～96 h以揮發(fā)盡無(wú)水乙醇，稱(chēng)取萃取后蘇木質(zhì)量，加適量DMSO配成1 000 mg/mL的萃取液原液，再取原液倍比稀釋成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90 mg/mL共8個(gè)質(zhì)量濃度。將巴西蘇木素單體和原蘇木素B單體分別用DMSO配制成64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL 共11個(gè)質(zhì)量濃度。

1.2.2.2菌液制備

將所有CRABA接種于血平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取數(shù)個(gè)分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,比濁儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5×108cfu/mL)。

1.2.2.3蘇木萃取液對(duì)10株CRABA的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測(cè)定

于無(wú)菌96孔板中每孔加入肉湯菌液100 μL，第1個(gè)孔加入1 000 mg/mL蘇木萃取液100 μL，采用微量倍比稀釋法，使蘇木萃取液質(zhì)量終濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81和3.90 mg/mL共8個(gè)濃度，每孔加入菌液20 μL。將96孔板放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.2.4巴西蘇木素對(duì)10株CRABA的MIC、MBC測(cè)定

于無(wú)菌96孔板中每孔加入肉湯100 μL，而后加入11個(gè)濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的巴西蘇木素溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作為陽(yáng)性對(duì)照，肉湯培養(yǎng)基200 μL作為陰性對(duì)照。將96孔板放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.2.5原蘇木素B對(duì)10株CRABA的MIC測(cè)定

于無(wú)菌96孔板中每孔加入肉湯100 μL，而后加入11個(gè)濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的原蘇木素B溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作為陽(yáng)性對(duì)照，肉湯培養(yǎng)基200 μL作為陰性對(duì)照。將96孔板放37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.3高效液相檢測(cè)蘇木組分

1.2.3.1樣品提取

稱(chēng)取蘇木各5 g置于錐形瓶中，加入乙醇100 mL，用封口膜把瓶口封好。超聲提取30 min，用0.22 μm有機(jī)膜濾膜過(guò)濾到樣品瓶中。

1.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取蘇木提取液、巴西蘇木素、DMSO，置于3個(gè)滅菌EP管中。

1.2.3.3高效液相色譜法檢測(cè)

采用C18(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相為乙腈∶水，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4CRABA的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CRABA，用無(wú)菌生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的100 μL肉湯培養(yǎng)基中，使肉湯中巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。每隔4 h進(jìn)行取樣，用酶標(biāo)儀檢測(cè)600 nm處的吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5十二烷基磺酸鈉(sodium 1-dodecanesulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CRABA，配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，? mL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的3 mL肉湯培養(yǎng)基中，使巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。置于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，于16 h取樣4 mL，3 155×g離心10 min，去除上清液，收集菌體；加入4 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)并萃取，洗滌1次(3 155×g離心10 min)，再加入2 mL PBS，取等體積(1 mL)的各標(biāo)本加入EP管，5 560×g離心5 min(23 ℃)收集菌體，重懸于160 μL PBS并加40 μL蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min轉(zhuǎn)速300 r/min后13 350×g離心10 min，取上清液備用。選用12%分離膠，5%濃縮膠，上樣20 μL進(jìn)行SDS-PAGE。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色1 h后脫色，顯示蛋白譜帶。

1.2.6巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

配制0.500 0、0.250 0、0.063 0、0.031 0 mg/mL的巴西蘇木素和0.256 0、0.128 0、0.064 0、0.032 0、0.016 0 mg/mL的美羅培南，將不同濃度的巴西蘇木素和美羅培南交叉配制為200 μL肉湯后加入96孔板，配制不同濃度的巴西蘇木素+美羅培南肉湯各200 μL加入96孔板，加入配制試驗(yàn)菌液20 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察結(jié)果。記錄MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并觀(guān)察兩藥聯(lián)用的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用，相加值最小數(shù)值為最佳組合，計(jì)算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，>0.5～1.0為相加作用，>1.0～2.0為無(wú)關(guān)作用，>2.0為拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 菌株藥敏檢測(cè)結(jié)果

藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，10株CRABA對(duì)哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素耐藥率為100%，對(duì)多黏菌素耐藥率為0。

2.2 MIC、MBC測(cè)定結(jié)果

蘇木萃取液對(duì)10株CRABA的MIC均為15.63 mg/mL，MBC均為15.63 mg/mL。巴西蘇木素對(duì)10株CRABA的MIC均為0.500 0 mg/mL，MBC均為0.500 0 mg/mL。原蘇木素B對(duì)10株CRABA的MIC均無(wú)效。

2.3 蘇木組分高效液相圖譜

DMSO的高效液相圖譜見(jiàn)圖1，蘇木萃取液的高效液相圖譜見(jiàn)圖2，巴西蘇木素的高效液相圖譜見(jiàn)圖3，說(shuō)明蘇木萃取液中產(chǎn)生抑菌作用的組分為巴西蘇木素。

圖1 DMSO高效液相色譜圖

A峰：DMSO；B峰：巴西蘇木素；C峰：原蘇木素B。圖2 蘇木萃取液高效液相色譜圖

A峰：DMSO；B峰：巴西蘇木素。圖3 巴西蘇木素高效液相色譜圖

2.4 巴西蘇木素對(duì)CRABA生長(zhǎng)的影響

巴西蘇木素藥物濃度越大，其對(duì)CRABA的抑制生長(zhǎng)作用越強(qiáng)，見(jiàn)圖4。

圖4 巴西蘇木素對(duì)CRABA生長(zhǎng)的影響

2.5 SDS-PAGE圖譜

隨著巴西蘇木素濃度的增大，其對(duì)CRABA的分泌蛋白抑制作用越強(qiáng)，見(jiàn)圖5。

M：蛋白標(biāo)記物；1：陰性對(duì)照；2：1/8 MIC；3：1/2 MIC；4：1 MIC。圖5 SDS-PAGE圖譜

2.6 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥細(xì)菌生長(zhǎng)抑制結(jié)果

美羅培南對(duì)CRABA的MIC為0.128 mg/mL，F(xiàn)IC指數(shù)為0.75，為相加作用，見(jiàn)表2、3。

表2 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥細(xì)菌生長(zhǎng)抑制情況表

表3 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合抗CRABA的棋盤(pán)法測(cè)定結(jié)果(MIC·mg-1·mL-1)

3 討 論

近年來(lái)隨著碳青霉烯類(lèi)藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性菌感染日益突出，其中CRABA所致感染的發(fā)生率和死亡率均較高，治療難度較大。CRABA對(duì)多粘菌素B的敏感性最高，耐藥率為1.4%，但因其腎臟和神經(jīng)毒性作用，臨床甚少使用。CRABA對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦、米諾環(huán)素、左氧氟沙星和阿米卡星的耐藥率分別為33.0%、42.2%、45.5%和40.2%。對(duì)頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和環(huán)丙沙星等耐藥率均在50%以上[8-9]。目前針對(duì)CRABA感染的治療手段非常有限，主要是頭孢哌酮-舒巴坦、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物。因此，針對(duì)CRABA探索新型藥物已成為研究的熱點(diǎn)。

蘇木的主要活性成分為生物堿，研究表明其中的巴西蘇木素在抗菌中起主要作用。LANE等[5]發(fā)現(xiàn)巴西蘇木素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.85 mm，MIC為12.5 μg/mL。SYAMSUNARNO等[10]發(fā)現(xiàn)蘇木中的巴西蘇木素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌及其他菌種具有很強(qiáng)的抑制作用，MIC為4～32 μg /mL。因此，本研究探討了蘇木活性成分對(duì)CRABA的體外抑菌作用，為中藥抑菌研究提供理論支持。

既往研究發(fā)現(xiàn)，大部分抑菌的中藥對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和蛋白譜的表達(dá)均有影響[11]，本試驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果。在不同濃度巴西蘇木素作用下，CRABA的生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)菌可溶性蛋白表達(dá)發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明巴西蘇木素對(duì)CRABA的抑菌作用可能與其影響細(xì)菌生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

目前中藥很少系統(tǒng)地被應(yīng)用于臨床，其主要原因在于中藥對(duì)細(xì)菌的抑制作用弱于常用抗菌藥物。然而有研究表明，某些中藥與抗菌藥物聯(lián)用可以產(chǎn)生明顯的增效作用，因此，中藥與抗菌藥物聯(lián)用成為新的研究思路。本研究創(chuàng)新性地將巴西蘇木素和美羅培南進(jìn)行聯(lián)合用藥試驗(yàn)以觀(guān)測(cè)對(duì)CRABA的抑制作用，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合用藥與單藥比較，抑菌效果得到了明顯增強(qiáng)。本研究雖然證實(shí)巴西蘇木素與美羅培南對(duì)CRABA有相加效應(yīng)，但從體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果分析，巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥要達(dá)到完全抑菌效果，巴西蘇木素藥物濃度較低時(shí)，美羅培南仍需較高濃度，如何使二者聯(lián)用發(fā)揮更好的抑菌作用，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，中藥抗菌具有較好的前景，貫穿于抗菌的各個(gè)環(huán)節(jié)。一方面，中藥可以直接作用于微生物本身，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性改變細(xì)胞通透性、抑制細(xì)菌生物被膜的形成[12-13]。另一方面，通過(guò)逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，促進(jìn)其他藥物的殺菌作用，如抑制耐藥菌外排泵、消除耐藥質(zhì)粒R[14-15]。本研究不足之處在于：(1)所采用菌株數(shù)量較少，且其藥敏檢測(cè)結(jié)果相同，故10株菌所得到的結(jié)果也完全相同，雖然表明研究的重復(fù)性較好，但所得結(jié)果不能證明巴西蘇木素對(duì)耐藥性不同的CRABA都有很好的抗菌作用，其結(jié)果存在一定的偏倚，為臨床提供的幫助存在局限性。(2)未對(duì)其他抑菌機(jī)制展開(kāi)研究，且僅處于體外試驗(yàn)階段，不能有效評(píng)價(jià)巴西蘇木素在體內(nèi)的療效。因此，未來(lái)將進(jìn)一步展開(kāi)試驗(yàn)以探討巴西蘇木素抑菌作用的機(jī)制，為體外試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)，使巴西蘇木素的抑菌活性得到真正發(fā)揮。