2018-2019年昆明市住院新生兒輪狀病毒感染及基因型分析

許小艷，孔 寧，甸子芩，楊景暉，田云粉，蘇麗娜，米弘瑛△

(1.云南省第一人民醫院兒科，昆明 650032；2.云南省昆明市兒童醫院檢驗科 650034；3.云南省第一人民醫院檢驗科，昆明 650032)

輪狀病毒(rotavirus，RV)是世界范圍內引起兒童非細菌腹瀉的最主要病原體，也是5歲以下兒童腹瀉死亡的首要原因[1]。新生兒感染RV的臨床表現及基因型有一定的特殊性[2]，但目前RV相關研究對象大多數為5歲以下的嬰幼兒，針對新生兒RV感染研究資料較少。本研究對2018-2019年昆明某三級甲等醫院住院新生兒進行糞便RV抗原檢測，收集臨床資料，進行RV基因型分析，旨在了解昆明地區新生兒RV感染的臨床及分子流行病學特征，為RV感染的防治提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年12月在昆明某三級甲等醫院新生兒病房住院的5 092例新生兒為研究對象。本研究獲醫院倫理委員會批準(批準號：2017YYLH039)。

1.2 方法

1.2.1標本及臨床資料收集

所有患兒入院48 h內檢測糞便RV抗原，入院48 h后出現腹瀉、嘔吐、腹脹、喂養不耐受等消化道癥狀體征時復測糞便RV抗原。RV抗原陽性病例收集糞便標本經離心處理后凍于-80 ℃冰箱，用于RV基因分型。同時收集RV陽性新生兒的臨床資料，包括胎齡、日齡、性別、分娩方式、出生體重、住院日期、住院病房類型、喂養方式、RV檢查時間和臨床表現等。

1.2.2RV抗原檢測

采用艾博生物醫藥(杭州)有限公司RV抗原檢測試劑盒(乳膠法)檢測糞便標本中RV抗原，操作方法嚴格按說明書進行。

1.2.3RV基因分型

1.2.3.1提取病毒RNA

取200 μL 10%的糞便懸液，采用TIANamp Virus RNA Kit提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取病毒RNA，操作方法嚴格按說明書進行。

1.2.3.2逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測

提取病毒RNA的陽性標本，以病毒的VP4和VP7核苷酸序列為模板，運用巢式RT-PCR方法(日本TaKaRa公司Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit)對RV進行基因分型。參照文獻[3]設計VP7和VP4基因特異性引物及反應體系。第1輪PCR反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃,無限循環。第2輪PCR反應條件：94 ℃ 290 s；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃,無限循環。

1.2.3.3基因測序與序列分析

標本的基因測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，以VP4(P分型)和VP7(G分型)內圍擴增引物為測序引物，正反向雙向測序。將測序得到的基因序列提交至互聯網(http://www.ncbi.ulm.nih.gov)，運用 BLAST工具進行堿基比對分析，確定G/P 基因型。

1.3 統計學處理

采用SPSS21.0軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 住院新生兒RV感染情況及季節分布

5 092例住院新生兒中共檢出糞便RV抗原陽性136例，總檢出率為2.67%。社區感染占總感染人數的64.71%(88/136)，醫院感染占35.29%(48/136)。新生兒RV感染全年均可發生，12月至次年2月為流行高峰季節，檢出率為3.32%～5.53%；其次為3-5月，檢出率為2.48%～3.10%；9月檢出率最低(1.45%)。社區感染及院內感染高峰期基本一致，但3-5月社區感染檢出率明顯下降，院內感染檢出率仍較高。

2.2 住院新生兒RV感染的臨床表現

136例RV感染的新生兒中，41例(30.15%)為無癥狀感染，95例(69.85%)有腹瀉、嘔吐和發熱等RV感染相關臨床癥狀。最常見的臨床癥狀為腹瀉，腹瀉發生率為60.29%(82/136)，大便多為黃色或黃綠色稀糊便或水樣便，每日4～11次，部分伴輕度脫水、腹脹、吃奶差、精神差及哭鬧等表現，但多為3～7 d 恢復正常。其次為發熱，20例(14.71%)出現發熱，體溫在37.5～39.0 ℃，6例(4.41%)以發熱為唯一或首發癥狀。7例(5.15%)有嘔吐表現，還有13例(9.56%)表現為便血、喂養不耐受及新生兒壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)等其他癥狀，其中NEC 2例。

比較RV感染的早產兒及足月兒臨床癥狀發現，早產兒無癥狀感染發生率略高于足月兒，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。足月兒腹瀉發生率高于早產兒，而早產兒其他癥狀的發生率高于足月兒，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 RV感染早產兒與足月兒臨床癥狀比較[n(%)]

2.3 新生兒RV感染基因型特征

2.3.1RV的基因多樣性

本研究共收集2018-2019年RV感染新生兒糞便標本101例，擴增并測序成功的VP7及VP4基因有89例(88.12%)。G分型中分出3種已知基因型，依次為G9、G2、G8。P分型中分出2種已知基因型P[8]和P[4]，最后確定本研究標本中共檢出4種基因型，主要基因型為G9P[8]，其次為G2P[4]、G2P[8] 及G8P[8]，見表2。

表2 昆明地區新生兒RV基因型分布[n(%)]

2.3.2RV主要基因型在不同分類新生兒中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在不同胎齡、住院病房、日齡、感染方式及有無癥狀的新生兒中分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 RV主要基因型在不同分類新生兒中分布[n(%)]

2.3.3RV主要基因型在不同癥狀新生兒中的分布

G9P[8]、G2P[4]基因型RV在腹瀉和無腹瀉、發熱和無發熱新生兒中分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 RV主要基因型在不同癥狀新生兒中的分布[n(%)]

3 討 論

3.1 昆明地區住院新生兒RV感染率及季節性分布

新生兒RV感染主要來源于孕產婦感染、產道感染及醫院內感染，醫院里可通過醫護人員造成RV的傳播。文獻報道NICU的新生兒RV檢出率為25.2%～43.9%，且醫院內感染占較大比例[2,4]。新疆地區新生兒病房RV感染的總檢出率為14.22%，院內感染占60.07%[5]。袁嬌等[6]報道NICU中RV檢出率為5.91%。本研究結果顯示昆明地區2018-2019年住院新生兒RV檢出率為2.67%，其中社區感染占總感染人數的64.71%，醫院感染占35.29%，總檢出率及院內感染占比均低于上述文獻。考慮為各地區氣候環境不同，RV感染檢測力度及醫院內感染的防治措施也不同，造成RV感染率地區差異。流行病學調查顯示，2005-2018年中國5歲以下兒童RV感染自9月開始上升至次年2月或4月回落，發病高峰季節為11月至次年2月[7]。昆明地區5歲以下兒童RV感染發病高峰期為每年的1-3月和10-12月[8]。本研究中新生兒RV感染的高峰期為12月至次年2月，與上述報道的5歲以下兒童RV感染流行季節高峰相符。但3-5月仍維持較高的感染率，9月感染率最低，與嬰幼兒流行季節特點不完全相同。本研究中新生兒RV醫院內感染與社區感染的季節分布基本一致，不同的是3-5月社區感染率已明顯下降，但醫院內感染率仍高，說明醫院內感染在RV流行高峰期后仍會持續一段時間，臨床需重視新生兒病房RV醫院內感染的防控。

3.2 新生兒RV感染的臨床表現

新生兒感染RV后可表現為無癥狀或輕型感染，也可表現為典型急性胃腸炎，還可表現為生命體征不穩定、喂養困難、NEC等嚴重癥狀[2,9]。本研究中30.15%的新生兒表現為無癥狀感染，69.85%的患兒有臨床癥狀，最常見的臨床癥狀為腹瀉，發生率為60.29%，部分伴輕度脫水、腹脹、吃奶差、精神差及哭鬧等表現，但多于3～7 d恢復正常。其次為發熱及嘔吐，另有9.56%的患兒以便血、喂養不耐受及NEC等為主要表現。所以臨床應給予及時有效的補液治療以緩解腹瀉相關癥狀，同時應注意患兒的其他表現，避免并發癥發生。有研究報道，新生兒感染RV后最常見癥狀是發熱而不是腹瀉或嘔吐[10]。本研究中新生兒RV感染后發熱的發生率為14.71%，且有4.41%的患兒以發熱為首發或唯一癥狀，說明有必要對發熱的新生兒進行糞便RV檢測。本研究還發現足月兒感染RV后腹瀉發生率高于早產兒，與鄭靈玲等[5]研究結論一致。早產兒喂養不耐受、便血及NEC等其他癥狀的發生率高于足月兒，但早產兒因胃腸功能不成熟及并發癥多等原因，即使不感染RV發生上述癥狀的風險也高于足月兒，且本研究為單中心研究，早產兒RV感染例數較少，不足以說明RV感染與早產兒喂養不耐受及NEC相關，尚需開展多中心研究，并排除干擾因素后進一步分析。

3.3 昆明地區新生兒RV基因型特征

RV基因型分布存在明顯地區及時間差異。G9P[8]型于1983年最初在美國發現，此后的10年關于G9型RV的報道較為少見，2000年以后G9P[8]型RV開始在世界各地零星暴發。在中國，G9型病毒最早于1998年在云南發現，此后該型病毒僅作為少見基因型偶然被報道。直至2011年，G9P[8]型RV快速取代了G1P[8]和G3P[8]型RV成為南京和武漢等地的優勢基因型。2009-2015年中國5歲以下腹瀉兒童RV流行監測顯示，RV優勢株從G3P[8]和G1P[8]迅速演變為G9P[8]，其中G9P[8]的比例從2009年的3.4%明顯增加到2015年的60.9%[11]。薈萃分析顯示，2011-2018年中國5歲以下兒童RV最普遍基因型是G9P[8]，占20.9%[12]。說明該型RV已經成為中國的優勢株。

昆明作為云南省會，是連接省內外的經濟和交通樞紐，建立以昆明為中心，輻射全省的RV感染和基因多樣性篩查網具有重要意義。昆明地區2006年以前嬰幼兒流行的RV以G1和G3P[8]為主。但由于此后近10年未對本地區流行的RV基因型進行監測，缺乏該時間段內RV的分子流行病學數據。而甸子芩等[8]對本地區2015-2017年RV流行病學調查顯示，G9P[8]型已成為本地區的優勢流行株，其次為G2P[4]型，G1P[8]和G3P[8]型明顯減少。本研究中新生兒最主要流行的基因型為G9P[8]型，占76.41%，與本地區嬰幼兒優勢流行株一致。近年在實施 RV 疫苗接種的國家中觀察到G2P[4]型RV毒株的流行率暫時增加[13-14]。文獻報道，昆明地區感染該基因型的兒童中年齡在2歲以下的占46.7%[3]。本研究中，G2P[4]型占21.35%，為本地區新生兒流行次要優勢株，說明該基因型已在昆明地區嬰幼兒及新生兒中流行。遺憾的是，之前的研究均是針對嬰幼兒或年齡更大的兒童，昆明地區新生兒RV基因型監測一直處在空白狀態，無法確定這兩種基因型在新生兒這一群體中的具體流行時間。

另外，新生兒感染的G9P[8]和G2P[4]兩個主要基因型在不同胎齡、住院病房、日齡、感染方式及有無癥狀的新生兒中分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。在腹瀉和無腹瀉，發熱和無發熱等不同癥狀的新生兒中分布亦無差異(P>0.05)。表明感染RV的基因型與胎齡、住院病房、日齡、感染方式與感染基因型無相關性，不同臨床癥狀與感染基因型也無相關性。但本研究鑒定基因型的RV例數較少，可擴大樣本量或開展多中心研究進一步探討RV基因型與臨床特征是否相關。

G1P[8]是韓國兒童中最常見的基因型，G4P[6]是新生兒中最常見的基因型，但2017-2018在新生兒中首次高頻率檢測到G8P[6]型的RV株[15]。在印度南部，G10P[11]型是新生兒感染RV的主要基因型，而這一基因型在其他年齡兒童中少見[16]。以上研究提示新生兒RV流行基因型與嬰幼兒可能不同，且有少見病毒株在新生兒群體中流行。本研究中新生兒RV流行的主要基因型與本地區嬰幼兒一致，但分別檢測到1株G2P[8]及1株G8P[8]型，這兩種基因型此前未在本地區兒童中檢出，表明需動態監測新生兒RV流行基因型變化趨勢，警惕少見基因型在新生兒中流行。

綜上所述，昆明地區住院新生兒RV感染率較低，流行季節特征與嬰幼兒不盡相同，醫院感染在流行高峰期后仍會持續一段時間，新生兒感染RV后以腹瀉癥狀最常見，足月兒更容易出現腹瀉癥狀，無癥狀感染及發熱在RV感染的新生兒中占一定比例。需重視無癥狀感染及醫院內感染，并開展發熱新生兒的RV檢測。新生兒RV主要流行基因型為G9P[8]、其次為G2P[4]，有少見的G8P[8]及G2P[8]檢出，需動態監測本地區新生兒RV流行基因型變化趨勢，并警惕少見基因型在新生兒中流行。