D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素殺菌效果分析

賴澤迎 吳澤源 楊曉樂 陳雅娟

賴澤迎，吳澤源，楊曉樂，等.D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素殺菌效果分析［J］.福建農業科技，2023，54（11）：36-43.

收稿日期：2023-09-10

作者簡介：賴澤迎，男，1997年生，碩士研究生，主要從事細菌耐藥研究。

*通信作者：陳雅娟，女，1979年生，博士，講師，主要從事細胞逆境響應與代謝調控研究（E-mail：cyj288@fjnu.edu.cn）。

基金項目：福建省自然科學基金面上項目（2019J01278）。

摘? 要：目前，開發抗生素佐劑以提高傳統抗生素殺菌效果是解決細菌耐藥的有效途徑之一。為了尋找新的抗生素佐劑，通過外源添加D-海藻糖與三大類殺菌抗生素對大腸桿菌BW25113和金黃色葡萄球菌ATCC25923進行殺滅測試，并通過在 D-海藻糖與氨基糖苷類抗生素聯合使用組中外源添加羰基氰化氯苯腙（CCCP），探究D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素潛在的殺菌機制。結果顯示D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果最佳，聯合殺菌組中外源添加CCCP后，細菌可恢復耐受表型。表明D-海藻糖有望作為新的抗生素佐劑，提示其聯合氨基糖苷類抗生素殺菌的機制與質子動力勢有關。

關鍵詞：D-海藻糖；氨基糖苷類抗生素；大腸桿菌；金黃色葡萄球菌

中圖分類號：Q 93??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）11-0036-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.11.006

Analysis of the Bactericidal Effect of D-trehalose Combined with Aminoglycoside Antibiotics

LAI Ze-ying， WU Ze-yuan， YANG Xiao-le， CHEN Ya-juan*

（Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation in Fujian Universities/College ofLife Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： At present， the development of antibiotic adjuvants to improve the bactericidal effect of traditional antibiotics is one of the effective ways to solve the bacterial resistance. In order to find the new antibiotic adjuvants， the killing tests of Escherichia coli BW25113 and Staphylococcus aureus ATCC25923 were carried out through the exogenous addition of D-trehalose and three major types of bactericidal antibiotics， and the potential bactericidal mechanism of D-trehalose combined with aminoglycoside antibiotics was explored by the exogenous addition of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone （CCCP） in the combined group of D-trehalose and aminoglycoside antibiotics. The results showed that D-trehalose combined with aminoglycoside antibiotics had the best killing efficacy on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. After the exogenous addition of CCCP in the combined sterilization group， the bacteria could restore the tolerance phenotype. It was indicated that D-trehalose was expected to be used as a new antibiotic adjuvant， suggesting that the antibacterial mechanism of D-trehalose combined with aminoglycoside antibiotics was related to the proton motive force.Key words： D-trehalose； Aminoglycoside antibiotics； Escherichia coli； Staphylococcus aureus

自1928 年，Alexander Fleming 發現了青霉素這一真正意義上的抗生素至今已有了將近百年的時間［1］。人類將抗生素廣泛運用于農林牧漁醫各個領域。然而，隨著抗生素的廣泛應用，促進了耐藥基因與耐藥細菌的快速出現［2］。細菌在抵御抗生素侵襲時已經進化出了多種耐藥機制。如細菌可通過主動外排［3］、產生鈍化酶［4］、降低細胞外膜的通透性［5］、對抗生素殺菌的靶點進行修飾［6］等方法以抵抗抗生素的殺傷作用。為了解決細菌耐藥問題，人類致力于開發新型抗生素和探索新的抗菌靶點。但是新型抗生素開發困難，研發周期長且成本高［7］。目前尋找抗生素佐劑以提高現有的傳統抗生素的療效是最主流的解決細菌耐藥的方法之一。

在尋找抗生素佐劑的過程中，研究中者們發現了一些理想的抗菌佐劑。有研究發現葡萄糖與氨基糖苷類抗生素聯合使用可很好地清除大腸桿菌的生物膜［8］。Hazel Gibson和Ayesha Rahman團隊也發現了利用酸性氨基酸與環丙沙星聯合用可有效地阻止金黃色葡萄球菌生物膜的形成［9］。此外，一些醇類、吲哚以及抗菌肽等代謝物也被報道可輔助氨基糖苷類抗生素殺滅致病性大腸桿菌［10-15］。與單獨使用抗生素進行殺菌相比，外源添加佐劑殺菌的效果更優。因此，開發一系列抗生素佐劑對控制細菌耐藥是種有效的手段之一。

本研究借鑒前人經驗聚焦于與葡萄糖結構相類似的D-海藻糖上，對D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素殺菌效果進行分析，以期將D-海藻糖作為新的抗生素佐劑。本研究通過外源添加D-海藻糖與三大類殺菌抗生素對大腸桿菌BW25113和金黃色葡萄球菌ATCC25923進行殺滅測試，確定與D-海藻糖聯用具有最佳殺菌效果的抗生素，并利用不同培養基對D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素進行殺菌測試，評估D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素在不同環境之中的殺菌效果，最后通過在 D-海藻糖與氨基糖苷類抗生素聯合使用組中外源添加羰基氰化氯苯腙（CCCP），探究D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素潛在的殺菌機制。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

以大腸桿菌模式菌株BW25113和金黃色葡萄球菌ATCC25923為試驗材料。氨基糖苷類抗生素：慶大霉素（Gentamycin，Genta）、鏈霉素（Streptomycin，Strep）、妥布霉素（Tobramycin，Tob）。喹諾酮類抗生素：氧氟沙星（Ofloxacin，Ofl）、環丙沙星（Ciprofloxacin，Cip）。β-內酰胺類抗生素：羧芐青霉素（Carbenicillin，Car）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）。

培養基、緩沖液及化學試劑：LB培養基（Luria-Bertani）、M9培養基、0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.9%生理鹽水、1 mol·L-1 D-海藻糖（D-Trehalose）溶液以及羰基氰化氯苯腙（CCCP）溶液。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 菌種活化與稀釋滴板方法? 取于-80℃存放的菌種按1∶100比例加入到1 mL的新鮮 LB液體培養基，于37℃搖床中過夜培養。取過夜活化好的菌液按1∶500比例接種于20 mL的新鮮LB培養基中，于37℃搖床中孵育24 h至平臺期。

取經不同試驗條件處理的50 μL平臺期的菌液至1.5 mL EP管中，13000 r·min-1，離心2 min去除上清，再用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次，最后加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體，使其與原菌液體系相同。隨后將菌懸液用 PBS緩沖液依次進行10倍梯度稀釋，最后取4 μL稀釋完的菌液滴于固體LB平板上。自然風干后，于37℃恒溫培養箱中培養12 h，觀察平板上存活的菌落數。

1.2.2? D-海藻糖聯合慶大霉素殺滅平臺期細菌的效果測試? 取4根干凈的搖菌管，分別編號1～4，再依次加入500 μL的平臺期大腸桿菌菌液。1號管為空白對照組，2號管加入D-海藻糖（10 mmol· L-1），3號管加入慶大霉素（30 μg·mL-1），4號管為D-海藻糖和慶大霉素雙處理組。最后將上述4個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

金黃色葡萄球菌試驗組的D-海藻糖濃度設置為30 mmol·L-1，慶大霉素濃度設置為100 μg·mL-1。同樣取平臺期金黃色葡萄球菌菌液500 μL分別加入4個搖菌管中，分別編號5～8。其中5號管為空白對照組，6號管加入D-海藻糖（30 mmol·L-1），7號管加入慶大霉素（100 μg·mL-1），8號管為D-海藻糖和慶大霉素雙處理組。最后將上述4個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

1.2.3? D-海藻糖聯合慶大霉素殺滅平臺期大腸桿菌的濃度梯度測試? 取10根干凈的搖菌管，分別編號1～10，再依次加入500 μL的平臺期大腸桿菌菌液。1號管為空白對照組，2～5號管為海藻糖單處理組，依次設置海藻糖濃度為10、30、50、80 mmol·L-1，6號管為慶大霉素單處理組，加入慶大霉素（30 μg·mL-1），7～10號管為D-海藻糖和慶大霉素雙處理組，按照預定的濃度順序添加D-海藻糖，然后在每個管中額外添加慶大霉素（30 μg·mL-1）。最后將上述10個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

1.2.4? D-海藻糖聯合慶大霉素殺滅平臺期金黃色葡萄球菌的濃度梯度測試? 取14根干凈的搖菌管，分別編號1～14，再依次加入500 μL的平臺期金黃色葡萄球菌菌液。1號管為空白對照組，2～7號管為海藻糖單處理組，依次設置海藻糖濃度為1、10、30、50、80、100 mmol· L-1，8號管為慶大霉素單處理組，加入慶大霉素（100 μg·mL-1），9～14號管為D-海藻糖和慶大霉素雙處理組，按照預定的濃度順序添加D-海藻糖，然后在每個管中額外添加慶大霉素（100 μg·mL-1）。最后將上述14個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

1.2.5? D-海藻糖聯合殺菌型抗生素殺滅平臺期細菌效果測試? 取16根干凈的搖菌管，分別編號1～16，再依次加入500 μL的平臺期大腸桿菌菌液。1號管為空白對照組，2～7號管為抗生素單處理組，分別加入妥布霉素（50 μg·mL-1）、慶大霉素（30 μg·mL-1）、鏈霉素（200 μg·mL-1）、環丙沙星（10 μg·mL-1）、氧氟沙星（10 μg·mL-1）、氨芐青霉素（200 μg·mL-1）、羧芐青霉素（200 μg·mL-1），8號管加入D-海藻糖（10 mmol·L-1），9～16號管為D-海藻糖和抗生素雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加D-海藻糖（10 mmol·L-1）。最后將上述16個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

金黃色葡萄球菌試驗組，同樣取16根干凈的搖菌管，分別編號1～16，再依次加入500 μL的平臺期金黃色葡萄球菌菌液。1號管為空白對照組，2～7號管為抗生素單處理組，分別加入鏈霉素（200 μg·mL-1）、慶大霉素（100 μg·mL-1）、妥布霉素（200 μg·mL-1）、環丙沙星（10 μg·mL-1）、氧氟沙星（10 μg·mL-1）、氨芐青霉素（200 μg·mL-1）、羧芐青霉素（200 μg·mL-1），8號管加入D-海藻糖（30 mmol· L-1），9～16號管為D-海藻糖和抗生素雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加D-海藻糖（30 mmol·L-1）。最后將上述16個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

1.2.6? 不同培養基中D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期細菌效果測試? 取平臺期大腸桿菌菌液500 μL分別加入8個1.5 mL EP管中，13000 r·min-1，離心2分鐘，去除上清，將菌體用500 μL的PBS緩沖液懸浮，進行兩次洗滌。最后，再次用500 μL的PBS緩沖液懸浮菌體，以還原至原始菌液的體系。再將菌液分別轉移至8個搖菌管中。1號管為空白對照組，2～4號管為抗生素單處理組，分別加入鏈霉素（200 μg·mL-1）、慶大霉素（30 μg·mL-1）、妥布霉素（50 μg·mL-1），5號管加入D-海藻糖（10 mmol·L-1），6～8號管為D-海藻糖和抗生素雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加D-海藻糖（10 mmol· L-1）。最后將上述8個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

金黃色葡萄球菌試驗組，取平臺期金黃色葡萄球菌菌液500 μL分別加入8個1.5 mL EP管中，13000 r·min-1，離心2 min，去除上清，將菌體用500 μL的PBS緩沖液懸浮，進行兩次洗滌。最后，再次用500 μL的PBS緩沖液懸浮菌體，以還原至原始菌液的體系。再將菌液分別轉移至8個搖菌管中。1號管為空白對照組，2～4號管為抗生素單處理組，分別加入鏈霉素（200 μg·mL-1）、慶大霉素（100 μg·mL-1）、妥布霉素（200 μg·mL-1），5號管加入D-海藻糖（30 mmol·L-1），6～8號管為D-海藻糖和抗生素雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加D-海藻糖（30 mmol·L-1）。最后將上述8個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

1.2.7? 羰基氰化氯苯腙對D-海藻糖聯合抗生素殺菌影響? 取15根干凈的搖菌管，分別編號1～15，再依次加入500 μL的平臺期金黃色葡萄球菌菌液。1號管為空白對照組，2～6號管為單處理組，依次分別加入D-海藻糖（30 mmol· L-1）、妥布霉素（200 μg·mL-1）、鏈霉素（200 μg·mL-1）、慶大霉素（100 μg·mL-1）、CCCP（20 μmol·mL-1），7～9號管為D-海藻糖和抗生素雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加D-海藻糖（30 mmol·L-1），10～12號管為抗生素與CCCP雙處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加CCCP（20 μmol·mL-1）。13～15號管為抗生素、CCCP與D-海藻糖三處理組，按照預定的濃度順序添加抗生素，然后在每個管中額外添加CCCP（20 μmol·mL-1）和D-海藻糖（30 mmol·L-1）。最后將上述15個搖菌管放于37℃搖床中，220 r·min-1，處理3 h。

2? 結果與分析

2.1? D-海藻糖聯合慶大霉素殺滅平臺期細菌的效果測試

由圖1A可知，慶大霉素（30 μg·mL-1）單處理組、D-海藻糖（10 mmol·L-1）單處理組在

殺滅大腸桿菌的效果上與空白對照組相比無顯著差異。而D-海藻糖與慶大霉素雙處理組的殺菌效果與慶大霉素單處理組相比增強了約3個數量級?？梢奃-海藻糖聯合慶大霉素殺菌效果更佳。

由圖1B可知，慶大霉素（100 μg·mL-1）單處理組、D-海藻糖（30 mmol·L-1）單處理組在殺滅金黃色葡萄球菌的效果上與空白對照組相比無顯著差異。D-海藻糖和慶大霉素的聯合處理組，在殺滅金黃色葡萄球菌的效果上相較于僅使用慶大霉素的處理組提高了大約3個數量級。證明D-海藻糖聯合慶大霉素可很好殺滅平臺期金黃色葡萄球菌。綜上所述，D-海藻糖聯合慶大霉素既可以殺滅革蘭氏陰性菌又可以殺滅革蘭氏陽性菌。

2.2? D-海藻糖聯合慶大霉素殺滅平臺期細菌的濃度梯度測試

由圖2 A可知，在0～80 mmol·mL-1的濃度范圍內，D-海藻糖的單獨處理未觀察到顯著的抗菌效果，而D-海藻糖與慶大霉素雙處理中，D-海藻糖在濃度為10 mmol·mL-1時開始顯示出與慶大霉素相輔相成的殺菌效果，但與濃度為30 mmol·mL-1時的殺菌效果相比，二者之間無顯著差異。所以，后續試驗將D-海藻糖濃度定為10 mmol·mL-1與抗生素聯合去殺滅大腸桿菌。

由圖2 B可知，在濃度范圍從0～100 mmol·mL-1的梯度內，D-海藻糖的單獨處理未觀察到顯著的抗菌效果。然而，在D-海藻糖與慶大霉素聯合處理中，即使在極低的濃度1 mmol·mL-1下，也觀察到了其輔助慶大霉素殺菌的現象，而當D-海藻糖濃度達到30 mmol·mL-1殺菌效果是最佳的。因此，后續研究將D-海藻糖濃度定為30 mmol·mL-1與抗生素聯合去殺滅金黃色葡萄球菌。

2.3 ?D-海藻糖聯合殺菌型抗生素殺滅平臺期細菌效果測試

由圖3A和圖3B可知，D-海藻糖與妥布霉素、慶大霉素和鏈霉素這3種氨基糖苷類抗生素聯合使用對平臺期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅表現出顯著的效果。然而，通過統計學分析，在D-海藻糖與環丙沙星以及氧氟沙星這兩種喹諾酮類抗生素的聯合處理中，并未觀察到在輔助殺菌效果方面存在顯著性差異。D-海藻糖與氨芐西林和羧芐青霉素這2種β-內酰胺類抗生素聯合使用對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅也沒有表現出顯著的差異。所以，D-海藻糖只有與氨基糖苷類抗生素聯合使用才具有輔助殺菌的功能。

2.4? 不同培養基中D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期細菌效果測試

由圖4A～C可知，D-海藻糖分別與妥布霉素、慶大霉素和鏈霉素聯合使用在M9、PBS和Nacl等培養基中對大腸桿菌殺菌效果效果明顯，組間差異極顯著（P<0.0001）。由圖4D～4E可知，在M9和PBS培養基中D-海藻糖輔助3種氨基糖苷類抗生素殺滅金黃色葡萄球菌效果顯著。但于Nacl培養基中，D-海藻糖聯合妥布霉素殺菌效果明顯。而當D-海藻糖和慶大霉素、鏈霉素聯用之時，D-海藻糖均無輔助殺菌的效果。D-海藻糖聯合氨基糖苷類抗生素在不同培養基中的殺菌效果不同可能是由不同培養基的離子濃度不同導致的。此外，D-海藻糖聯合妥布霉素在不同的培養基當中殺菌效果都較好。因此，在臨床應用時可多考慮使用妥布霉素與D-海藻糖聯用殺菌。

2.5? 羰基氰化氯苯腙對D-海藻糖聯合抗生素殺菌影響

圖5C結果顯示CCCP與抗生素雙處理可以很好地殺滅金黃色葡萄球菌，這與李中燕等人發現CCCP聯合氨基糖苷類抗生素可以很好地殺滅多種病原菌結果相符合［16］。由5圖D可知，在D-海藻糖與抗生素雙處理組之中外源添加CCCP，細菌可恢復耐受表型。由此可以猜測，D-海藻糖促進氨基糖苷類抗生素殺菌可能是由于D-海藻糖提升了細菌體內的質子動力勢（PMF），從而促進了細菌對抗生素的攝取而造成細菌的死亡。

3? 結論與討論

隨著時間的推移，全球范圍內抗生素應用范圍越來越廣，細菌對于抗生素的耐藥性也越來越強，細菌耐藥危機已經出現［17］。細菌耐藥不僅對農林牧漁業生產造成嚴重影響，也對人類的生命健康構成了巨大的威脅。細菌感染會不斷地增加國家醫療支出，對國家和民眾造成很大的負擔。這也會造成不發達國家和地區貧富差距進一步拉大［18］。目前世界各國科學家都在積極尋找有效殺滅和抑制耐藥菌的策略。其中最有效且實用的策略便是尋找抗生素增效劑，增強傳統抗生素的殺菌效果。

本研究通過一系列試驗證實了聯合使用D-海藻糖和氨基糖苷類抗生素可以有效消滅平臺期大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。而且發現在不同培養基中D-海藻糖聯合妥布霉素的殺菌效果均良好。此外，在 D-海藻糖與氨基糖苷類抗生素聯合使用組中外源添加CCCP，發現細菌可以恢復耐受表型。此試驗結果提示，D-海藻糖促進氨基糖苷類抗生素殺菌可能是由于D-海藻糖提升了細菌體內的PMF，從而促進了細菌對抗生素的攝取而造成細菌的死亡。至于D-海藻糖是否還可以通過其他途徑增強氨基糖苷類抗生素殺菌，后續還需對其殺菌機制進行進一步的研究。

本研究所使用的D-海藻糖是一種生物代謝物。許多生物代謝物都是無毒無害的，本實驗室致力于對生物代謝物抗菌這方面的研究，期望尋找到一些新的、有效的抗菌代謝物并進行大量生產應用于醫藥、工業、農業以及食品等領域，切實地解決細菌耐藥難題。

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（責任編輯：柯文輝）