膠東地區不同家禽MSSA和MRSA的流行分布與耐藥性分析

肖 震，劉 娜，趙建梅，李 彥，隋明華，王 娟，段笑笑，韓 云，劉俊輝，王 琳，張青青，黃秀梅，高玉斌，王君瑋，曲志娜*，劉煥奇

(1. 中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032；2. 青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109；3. 青島市動物疫病預防控制中心，山東 青島 266041；4. 萊西市農業農村局，山東 青島 266600)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)廣泛分布于世界各地，是人類和其他動物多種感染病的主要病原菌，包括輕微的細菌感染甚至到危及生命的菌血癥[1-2]。金黃色葡萄球菌的來源報道最早可以追溯到1880年，當時亞歷山大·奧斯頓(Alexander Ogston)從手術傷口感染中分離出金黃色葡萄球菌。這種分離的微生物能夠在注射到豚鼠和小鼠體內時產生膿腫。[3-4]近年來，隨著全球范圍內抗生素藥物的廣泛使用，金黃色葡萄球菌耐藥狀況日趨嚴重，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為典型代表的多重耐藥菌株的相關報道漸增。有研究顯示，全球不同地區MRSA的感染率占到金黃色葡萄球菌總檢出數量的30%～60%，且呈逐年上升趨勢[5]。MRSA主要是由mecA編碼低親和力青霉素結合蛋白2a (PBP2a)而產生耐藥性[6]，該蛋白對所有β-內酰胺類抗菌素(青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類)具有低親和力，使葡萄球菌對這一大型和關鍵的抗菌素類產生耐藥性[7-8]；也有一小部分由于質粒介導產生的β2內酰胺酶而產生耐藥性。有分析證實家畜接觸和人類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌傳播之間呈正相關，農場人員和職業接觸豬或家禽的工人也面臨著被家畜相關MRSA (LA-MRSA)感染的高風險。[9-11]因MRSA感染率高，致死率高，對多種抗生素耐藥，成為全球性臨床治療難點，不僅嚴重威脅人類公共衛生安全，而且畜禽攜帶耐藥菌，也會因治療困難給養殖業生產帶來巨大的經濟損失。由于動物源細菌耐藥性存在時間、空間、動物間等流行分布差異，且MRSA的報道多以牛源、豬源為主，禽源報道較少。因此，本研究通過分析青島地區不同禽源MSSA和MRSA的流行及耐藥情況，采取有針對性的干預措施。本研究旨在評估青島地區蛋雞、肉雞、水禽三種不同家禽共2730份咽拭子樣品中MSSA和MRSA的流行情況、耐藥特征及spa優勢型別，為該地區防控MRSA及臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 金黃色葡萄球菌顯色培養基、MRSA顯色培養基購于上海欣中生物工程有限公司；7.5%氯化鈉肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂，購于北京陸橋技術股份有限公司；基質、裂解液，均購于鄭州安圖生物工程股份有限公司，Go Taq Green Master Mix、DNA Marker DL1 000購于TaKaRa公司，核酸染料、瓊脂糖；96孔藥敏板，購于上海星佰生物技術有限公司；生物安全柜；細菌恒溫培養箱；MS1000全自動微生物質譜檢測系統； PTC200 基因擴增儀；電泳儀、XR凝膠成像分析儀；比濁儀；渦旋混勻儀等。金黃色葡萄球菌ATCC 29213和MRSA ATCC 33591均由中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室提供。

1.2 樣品來源 2021年8月至10月期間，在膠東地區從49個養殖場(蛋雞場15個、肉雞場22個、水禽 (肉鴨、鵝) 場12個)采集2730份咽拭子，用于本實驗研究。

1.3 金黃色葡萄球菌、MRSA的分離與鑒定 將采集的咽拭子置于預先盛有7.5%氯化鈉肉湯的離心管中，37 ℃恒溫培養18 h后，三區劃線分別接種于金黃色葡萄球菌顯色培養基和MRSA顯色培養基，37 ℃培養18～24 h，挑取疑似陽性單菌落，再次劃線于上述兩種顯色培養基中，重復操作3次，挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆培養基中，37 ℃培養18～24 h后，挑取單菌落涂布到96孔靶板上，使用MS1000全自動微生物質譜檢測系統鑒定。上述步驟同時以質控菌株ATCC 29213做陽性對照。

選取部分金黃色葡萄球菌菌株，煮沸法粗提細菌DNA作為PCR模板，參考文獻[12]設計mecA引物，見表1。反應體系：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，DDH20補足25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,30個循環，72 ℃再延伸5 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，電泳緩沖液濃度為1×TAE，130V，25 min，凝膠成像儀觀察結果。同時以質控菌株ATCC33591作為陽性對照同步進行。

1.4spa分型 選取214株MRSA和137株 MSSA 進行spa分型實驗。查閱文獻[13]并參照設計引物如表1所示。由擎科生物科技有限公司合成。反應體系設置為Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，DDH20補足25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35個循環；最后72 ℃延伸7 min。擴增后產物送由擎科生物科技有限公司測序。spa基因重復序列區域5’端的標志序列為RCAMCAAAA，3’端的標志序列為TAYATGTCGT。按此規則截取spa基因重復序列區域，并按照24 bp分割成不同的重復單元，結果提交至spa分型數據庫(http:∥www.ridom.de/spaserver/)進行分型分析。

表1 引物序列及目的片段大小Tab 1 Primer sequences and target fragment sizes

1.5 藥敏試驗 選取97株MSSA和102株MRSA，采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，使用96孔藥敏板測定13大類18種抗菌藥的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration, MIC)，并根據CLSI的判定標準獲得實驗菌株敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)的結果。同時使用質控菌株ATCC 29213同步進行，質控菌株在質控范圍內，且陽性對照有菌生長、陰性對照無菌生長，則結果判讀有效。對3類及3類以上抗菌藥同時耐藥即為多重耐藥。

1.6 數據統計及處理 使用SPSS 26.0軟件、卡方檢驗進行統計及差異顯著性分析，P≤0.01，則差異極顯著，用“**”表示；0.010.05，則差異不顯著，用“ns”表示。利用BioNumerics 7.6 軟件構建了基于spa型別的最小生成樹。在最小生成樹中，一個圈代表一個spa型，圈的大小代表菌株數量的多少，圓圈之間的距離代表親緣關系遠近。

2 結果與分析

2.1 MSSA和MRSA菌株分布情況 2730份咽拭子樣品中，共分離到金黃色葡萄球菌742株，總體分離率為27.18%。其中MSSA 528株，MRSA 214株，分離率分別為19.34%和7.84%。從不同家禽看，水禽源菌株總體分離率最高(38.33%)，其次是蛋雞(28.45%)、肉雞(20.33%)。無論是MSSA還是MRSA在水禽中分離率均為最高(27.58%、10.76%)且青島地區蛋雞、肉雞、水禽三種不同來源的菌株分離率均有極顯著差異。詳見表2。

表2 青島地區不同家禽MSSA和MRSA分離率(菌株數/采樣量)Tab 2 MSSA and MRSA isolation rates in different poultry species in Qingdao, China(number of strains / sample size)

2.2spa分型結果 對214株MRSA和137株 MSSA的PCR擴增產物進行凝膠電泳和測序比對，獲得16種spa型別，詳見表3。對不同禽源分離菌株建立了基于spa型別的最小生成樹，展示了肉雞、蛋雞及水禽分離菌株的種群結構及菌株間親緣關系，詳見圖1～圖3。其中，MRSA 有7種spa型，分別為t899(204，95.30%)、t1939(1.87%)、t034(0.93%)、t4558(0.47%)、t1250(0.47%)、t1793(0.47%)、t15591(0.47%)。MSSA有12種spa型，分別為t899、t034、t002、t010、t011、t1793、t2247、t267、t3041、t3155、t5268、t571，其中t899共97株(70.80%)， t034有11株(8.00%)、t010、t2247均有6株(各占4.40%)、t3041、t002、t5268均有3株(各占2.20%)、t1793、t267、t571均有2株(各占1.46%)、t011、t3155均有1株(各占0.73%)。

表3 青島地區不同家禽來源MSSA和MRSA spa 分型結果Tab 3 Results of MSSA and MRSA spa typing from different poultry sources in Qingdao, China

圖1 137株 MSSA與214株MRSA基于不同家禽來源和spa型別的最小生成樹Fig 1 Minimum spanning tree of 137 MSSA and 214 MRSA by different poultry and spa type(注： A：所有菌株；B：MSSA；C：MRSA DJ: 蛋雞 RJ: 肉雞 SQ:水禽)

圖2 青島地區禽源MSSA與MRSA的耐藥率比較Fig 2 Comparison of resistance rates between avian derived MSSA and MRSA in Qingdao, China

從不同家禽看，蛋雞來源的菌株共得到7種spa型，t899共102株(MSSA 38株，MRSA 64株)，其次是t010共6株，t002共3株，t2247共2株，t034、t3041、t3155各1株，其中，t010、t002、t3155僅在蛋雞中分布，t034、t3041在蛋雞，肉雞，水禽來源的樣品中均有分布。蛋雞來源的MRSA菌株均為t899型別。肉雞來源的菌株共得到8種spa型，MSSA中， t899共有30株，t034共6株，t2247共4株，t571共2株，t3041、t011各1株。MRSA中，t899共有74株，t1939共4株，t011、t4558各1株。t571、t011僅在肉雞中分布。水禽來源的菌株共得到8種spa型，MSSA中t899共有29株，t034共有4株，t5268共有3株，t1793、t267各有2株，t3041有1株。MRSA中，t899共有66株，t034共有2株，t1793、t1250、t15591各有1株。其中t1793、t5268、t267僅在水禽中有分布。

2.3 藥敏實驗結果 根據CLSI的判定標準，97株MSSA及102株MRSA對18種藥物的耐藥情況見表4。青島地區分離到的禽源MSSA和MRSA均對18種藥物均有不同程度的耐藥。97株MSSA對青霉素、紅霉素、喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星)的耐藥已十分嚴重，耐藥率均已達到80%以上，對磺胺異噁唑、利奈唑胺、多西環素較為敏感，耐藥率均在10%以下。對克林霉素、氟苯尼考、替米考星、慶大霉素均表現中等程度以上的耐藥，耐藥率在60%～80%之間。對其余藥物的耐藥率在20%～50%之間。102株MRSA對青霉素、紅霉素、克林霉素、喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星)、氟苯尼考、替米考星等藥物耐藥嚴重，耐藥率均達到100%，對頭孢類、苯唑西林、泰妙菌素、慶大霉素耐藥率也在90%以上，對阿莫西林/克拉維酸表現中等程度以上的耐藥，耐藥率為77.45%。對利奈唑胺、多西環素同樣敏感，耐藥率均低于5%。對磺胺類藥物的耐藥率在10%～50%之間。MSSA與MRSA中均未分離到萬古霉素耐藥菌株。表4和圖2顯示，除磺胺異噁唑、萬古霉素、復方新諾明、多西環素、利奈唑胺5種藥物外，MRSA對其余13種藥物耐藥率均極顯著高于MSSA(P<0.01)。

從不同家禽看，蛋雞、肉雞、水禽三種家禽來源的MSSA菌株對克林霉素、磺胺異噁唑、替米考星耐藥差異極顯著(P<0.01)，對紅霉素、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林差異顯著(P<0.05)，對其余11種藥物無統計學差異。蛋雞、肉雞、水禽三種家禽來源的MRSA菌株對阿莫西林/克拉維酸、磺胺異噁唑、泰妙菌素差異極顯著(P<0.01)，對慶大霉素差異顯著(P<0.05)，對其余藥物無統計學差異。

2.4 多重耐藥結果 191株金黃色葡萄球菌多重耐藥，總體多重耐藥率為95.98%(191/199)。其中，97株MSSA中多重耐藥株共有89株，占比為91.75%，集中分布在6～8耐，未分離到10耐以上菌株。102株MRSA菌株均為多重耐藥株，且均在5耐以上，集中分布在9～10耐。多重耐藥結果見圖3及表5。

圖3 青島地區三種家禽來源MSSA與MRSA的多重耐藥結果Fig 3 Multi drug resistance results of MSSA and MRSA from three poultry sources in Qingdao, China

從不同家禽看，MSSA中，蛋雞耐藥重數較為分散，從0耐到10耐均有分布，其中7耐、8耐占比最多，肉雞耐藥重數分布較為集中，7耐所占比例最多，水禽耐藥重數多集中在8耐，其次是6耐，均無10耐及以上菌株。MRSA中，蛋雞、肉雞、水禽三種家禽來源的菌株耐藥重數均很集中，均有過半比例(64.44%、68.18%、68.25%)為9耐菌株。

表5 青島地區三種家禽來源MSSA與MRSA的多重耐藥結果Tab 4 Multi drug resistance results of MSSA and MRSA from three poultry sources in Qingdao, China

3 討 論

金黃色葡萄球菌廣泛分布于世界各地區、各類動物體內，隨著抗菌藥的廣泛使用導致耐藥菌株不斷增多，以MRSA為代表的耐藥菌株報道較多，尤以豬源、牛源為主，近年來禽源樣品也有報道。范麗霞等人針對山東地區畜禽糞污進行了金黃色葡萄球菌的分離鑒定，結果顯示80份樣品中有3份檢出有金黃色葡萄球菌，分離率達到3.75%。[14]低于本研究，推測原因在于糞樣樣本與咽拭子樣本等不同樣本形式對最終分離率存在影響，咽拭子分離率較高而糞樣較低。王龍光對膠東地區生豬生產鏈各環節分離鑒定，2556 份樣品共分離出 MSSA 386 株(15.10%)，MRSA 122 株(4.77%)，SA 的分離率為19.87%，[15]低于本文禽源樣本分離率。陳瑤等對重慶市多個動物源(豬、雞、牛、羊、兔)進行糞樣采集及金黃色葡萄球菌分離鑒定，其中豬源分離率較高，而雞源金黃色葡萄球菌分離率僅占7.6%[16]。四川省不同地區養禽場(雞、鴨)MRSA檢出率在22.95%[17]。韓國學者Song等在一份報告中指出，奶牛乳腺炎乳樣中，MRSA的檢出率有逐年上升的趨勢，從 1.3%(2003)、2.5%(2007)、4.3%(2011)上漲到13.9%(2012)[18]。在Saliha Bounar-Kechih的一項研究中，從阿爾及利亞北部地區的蛋雞和肉雞屠宰場采集了共8375份樣品，其中金黃色葡萄球菌在蛋雞和肉雞中分離率分別為42%和 12%[19]。本實驗所用樣品均來源于青島地區的三種不同家禽，具有廣泛代表性。2730份咽拭子樣品中，金黃色葡萄球菌、MSSA、MRSA分離率分別為27.18%、19.34%和7.84%。其中，水禽來源的金黃色葡萄球菌的整體分離率及MRSA分離率均顯著高于蛋雞和肉雞來源菌株。綜上所述，不同國家及地區、不同動物甚至不同品種家禽來源的MSSA及MRSA分離率不盡相同，原因可能在于不同國家、不同地區的細菌流行情況、養殖規模化程度以及畜禽飼養管理不同，導致分離率出現差異。

spa分型結果顯示，無論是從不同家禽來源來看還是從青島不同市區來看，t899在MSSA和MRSA菌株中均為優勢型別。葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A)是金黃色葡萄球菌細胞壁的組成部分和重要的毒力因子，包括Fc結合區，X區和C末端H區域。X區是由24 bp 重復序列串聯而成的可變重復區域[20],基因呈現高度多態性[21],良好的重復性及穩定性，廣泛用于金黃色葡萄球菌的分型研究。顏文光等人在研究中發現62株動物源(豬、牛、羊、鴨)金黃色葡萄球菌菌株中共檢測到17種基因型，檢測到最多的型別為t899(30.65%)[22]。何文強等人對青島省相關雞肉產品調查后發現，主要的 MRSA 克隆是 ST9-t899 SCCmecIVb/PFGE A (70.0%, 14/20)。在 MSSA 分離株中，ST9-t899/PFGE A 最為普遍(27.6%)，均與本文結果相近[23]，說明青島地區家禽源金黃色葡萄球菌也是以t899型別為主的克隆傳播。但應注意，部分型別僅在蛋雞(t010、t002、t3155)或肉雞(t571、t011)或水禽(t1793、t5268、t267)中分離到。

藥敏結果顯示， MSSA對多種藥物顯示出高水平耐藥， MSRA更甚。二者對青霉素、紅霉素、喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星)耐藥率均已超過80%。三種家禽來源中，肉雞來源的菌株對克林霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、替米考星的敏感性低于其余兩種來源，蛋雞來源的菌株對泰妙菌素、慶大霉素的敏感性低于其余兩種來源，水禽對頭孢類藥物(頭孢噻呋、頭孢西丁)、苯唑西林的敏感性低于其余兩種來源，因此，在臨床用藥的選擇上，對不同家禽應注意規避上述對應低敏性藥物的使用。國內有研究報道顯示，雞源金黃色葡萄球菌對大多數抗生素具有耐藥性，其中對青霉素、紅霉素耐藥率較高，甚至接近于 100%[24]。本文結果顯示，實驗菌株對利奈唑胺、多西環素耐藥率較低，低于10%，且未發現萬古霉素耐藥菌株。此結果與李淑敏[25]Nelisiwe Mkize[26]等人的研究結果相近。顏敏等采集了病鴨的關節滲出液、肝臟、脾臟組織，使用紙片擴散法對分離的金黃色葡萄球菌進行藥敏實驗，結果顯示分離株對青霉素、鏈霉素、環丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素高度耐藥；對慶大霉素、四環素、卡那霉素、新霉素中度耐藥，對阿莫西林、氟苯尼考、強力霉素、紅霉素、阿米卡星較為敏感，對米諾環素、頭孢拉定、頭孢噻肟高度敏感[27]，與本文結果略有差異。究其原因，可能由于不同養殖場具體用藥情況差異所致。因此，臨床使用抗生素藥物時應減少青霉素、大環內酯類、喹諾酮類、克林霉素等低敏性藥物的使用頻率。

本文研究結果顯示，金黃色葡萄球菌多重耐藥情況嚴重。MSSA和MRSA多重耐藥率分別高達91.75%、100%，耐藥重數集中分布在6～8耐、9～10耐。林杰等的研究中顯示，雞源心肝脾組織分離到的金黃色葡萄球菌的絕大多數(73.9%)同時對5種以上抗生素耐藥，表現顯著的多重耐藥現象[28]，結果與本文相似。劉茜從安徽皖中地區采集的病禽肝臟組織中分離金黃色葡萄球菌并采用 K-B 法進行藥敏試驗，結果顯示，耐藥重數以5耐、6耐居多[29]，耐藥重數略低于本文。值得注意的是，本文中MSSA和MRSA菌株均對多西環素的中介率較高，分別達到19.59%和82.35%，暗示二者對其的耐藥率在未來有上升的可能性。總的來說，國內外各研究中MSSA與MRSA耐藥及多重耐藥結果雖有出入，但均顯示二者對多種抗菌藥的耐藥情況嚴峻，多重耐藥菌株耐藥性上升，未來防控更加艱難，給養殖業的發展及公共衛生問題帶來巨大阻礙。

金黃色葡萄球菌在青島地區不同家禽中均有不同程度的分布，且分離菌株耐藥現象較為普遍，其中MRSA耐藥尤為嚴重，存在耐藥菌株傳播給人的風險，對人類健康具有安全隱患。耐藥菌株雖然呈現“型多面廣”的現象，但主要是以t899型別為主的克隆傳播，因此應通過分子溯源技術深入了解各地區中金黃色葡萄球菌的流行趨勢，結合耐藥表型監測，規范獸用抗菌藥的使用，為MSSA和MRSA的有效防控提供依據。

4 結 論

金黃色葡萄球菌(MSSA、MRSA)在青島地區家禽中分布較為廣泛，且在不同家禽中的攜帶情況存在差異，水禽攜帶MSSA和MRSA的現象較其它兩種家禽更為普遍；MSSA和MRSA均是以t899為主的克隆傳播；青島禽源金黃色葡萄球菌對多種抗菌藥普遍耐藥，且MRSA較MSSA耐藥更為嚴重，均為多重耐藥菌株。綜上所述，應加強家禽養殖過程中耐藥菌株的流行病學調查與分析，規范獸用抗菌藥的合理使用與監管，以有效遏制耐藥菌株的產生與傳播。