金黃色葡萄球菌天然抗生物被膜物質研究進展

于 娜，劉義明，王玉鳳，陳孝杰，李秀波

(中國農業科學院飼料研究所/農業農村部動物源細菌耐藥性監測重點實驗室/國家飼料中藥物基準實驗室/農業部動物產品質量安全飼料源性因子風險評估實驗室，北京 100081)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一，主要通過侵入并定植于奶牛乳腺上皮細胞引起奶牛乳房炎，引起慢性乳房內感染[1]。金黃色葡萄球菌能夠永久性損傷乳腺的泌乳組織，然后被非分泌組織取代，削弱了奶牛的產奶性能[2]。在乳房炎的治療過程中，由于養殖場用藥不當等原因，導致牛乳中藥物殘留，且金黃色葡萄球菌及其分泌的毒素等可存在于牛乳中[3]，受污染的生牛乳可能會進一步沿著食物鏈，導致與之相關的食品污染[4]，造成嚴重的食源性疾病，威脅人類健康。

細菌生物被膜(Bacterial biofilm, BF)是一個有著復雜三維結構的微生物群，是細菌粘附于接觸表面后分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白以及胞外DNA(eDNA)等，并將其自身包繞其中，形成的大量細菌聚集群落[5]。生物被膜內的細胞被自身產生的基質包裹，有利于在惡劣或極端環境中生存[6]。生物被膜的胞外聚合物(Extracellular polymericsubstances, EPS)能夠阻礙抗生素以及其他藥物的進入，免受免疫系統的攻擊，從而使耐藥性增加。因此，與游離的細菌相比，以生物被膜群落形式存在的細菌對抗生素的敏感性更低[7]，其引起的奶牛乳房炎感染更難治愈。

農業農村部制定了《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021-2025年)》來切實加強獸用抗菌藥治理。為響應農業農村部獸用抗菌藥使用減量化行動，降低抗生素的使用量，獸醫研究者力尋新型抗菌劑。研究發現，中藥成分及植物提取物、生物表面活性物質和噬菌體等天然抗生物被膜物質，能夠通過改變生物被膜生成相關基因的表達、抑制生物被膜粘附和干擾群體感應途徑等機制有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜。這為防治金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎提供了新的思路。

1 金黃色葡萄球菌生物被膜耐藥機制

1.1 滲透屏障作用 生物被膜胞外聚合物(Extracellular polymeric substances, EPS)是由蛋白質、胞外多糖、eDNA和脂質等組成的一種生物大分子復雜混合物，能夠降低細菌對抗菌藥物的敏感性[10]。Campanac等[9]研究發現，去除金黃色葡萄球菌生物被膜的EPS能使該菌對季銨化合物的耐藥性顯著下降。Jefferson等[10]發現苯唑西林、頭孢噻肟和萬古霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜的穿透擴散能力有限，證實了生物被膜的屏障作用，有助于降低細菌對某些抗生素的敏感性。生物被膜屏障作用的分子機制主要是胞外基質中特定大分子結合抗生素分子。此外，EPS會阻礙與其帶相反性質電荷的抗生素的滲透[11]，EPS上的eDNA與抗生素物理作用，將基質中的抗生素與藥物靶位屏障隔離，從而增加生物被膜對抗生素的耐藥性[12]。

1.2 新陳代謝降低和嚴謹反應 生物被膜耐受性機制主要包括細菌生長速率降低和營養限制下的嚴謹反應(stringent response)[7]。生物被膜內細菌較普通游離細菌新陳代謝速度和生長速度降低，在抗生素處理下會進入休眠狀態，僅維持核心代謝以適應環境脅迫[13]。休眠狀態下的細菌對抗生素敏感度降低甚至幾乎完全不敏感，導致這些細菌亞群能夠承受遠高于MIC的抗生素濃度從而逃避抗生素的殺菌作用。嚴謹反應是細菌營養限制(缺乏氨基酸)時，核糖體在合成蛋白質時發生空轉反應，(p)ppGpp合成酶通過與核糖體的相互作用，合成信號分子(p)ppGpp，以此使細菌對其生存環境做出適應性調控[14]。細菌通過減緩生長來增加氨基酸合成，增加其耐藥性。金黃色葡萄球菌生物被膜嚴謹反應的激活可能會減慢生物被膜內噬菌體的前進速度，有助于細菌細胞適應環境的改變[15]。

1.3 群體感應 細菌在生物被膜內通過群體感應(quorom sensing, QS)系統進行“通訊”，傳遞各種信息以調控基因表達、細菌活動，來適應生存環境的改變。金黃色葡萄球菌最重要的QS系統是群體感應輔助基因調節系統(accessory gene regulator，agr)，agr能夠檢測自誘導肽(autoinducing peptides, AIPs)，進而調控生物被膜的成熟和分散[16]。在細菌聚集過程中，細菌密度逐漸增加，AIPs的濃度也在增加，當AIPs達到閾值時，就會激活細菌生物被膜上的雙組分信號轉導系統agrC-agrA，再轉化為菌體細胞內的生化信號，細菌產生適應性的生化反應。金黃色葡萄球菌agr對其毒力表達具有雙重調節作用。細菌在高細胞密度條件下，agr能增加多種毒力因子的產生，降低多種定殖因子的表達[17]。當細菌密度比較低的時候，agr上調細胞粘附蛋白和抵御宿主防御的相關蛋白，直到不斷增長的細菌群能夠抵御宿主防御系統的攻擊[18]。Yarwood等[19]指出在金黃色葡萄球菌中，群體感應缺失的agrD突變體對利福平的耐藥性表現出特異性的下降。此外，群體感應抑制劑金縷梅單寧(2′, 5-di-O-galloyl-d-hamamelose; HAM)能抑制Trap群體感應受體，可通過減少肽聚糖的合成、細胞壁厚度和生物被膜基質中eDNA含量，來提高頭孢菌素、萬古霉素等抗生素抗菌效果[20]。

1.4 外排泵的外排作用 細菌生物被膜的外排泵是一種膜蛋白，能將細菌內的有害物質(抗生素、代謝廢物、毒素等)排出到外部環境，以維持細菌細胞內穩定[21]。研究表明，外排泵排出藥物是細菌產生抗生素耐藥性的主要機制之一，在生物被膜形成過程中，外排泵協助生物被膜形成的方式有：EPSs和/或QS分子的外排和群體猝滅(quorum quenching, QQ)分子分別促進生物被膜基質的形成和調節QS；生物被膜形成相關基因的間接調控；有害分子外排(如抗生素等)；通過促進或防止粘附到表面和其他細胞而聚集[22]。金黃色葡萄球菌主要易化子超家族(Major facilitator superfamily, MFS)目前研究最多，如NorA可以排出氟喹諾酮類藥物和季銨鹽化合物[23]。

2 金黃色葡萄球菌天然抗生物被膜物質

2.1 中藥成分及植物提取物 近年來，中藥成分及植物提取物對抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的研究越來越多，目前了解到的大多是通過抑制生物被膜的QS系統和粘附階段來實現的。研究表明，一些酚類化合物[24-25](山奈酚、香芹酚)和一些黃酮類化合物[26-27](黃芩苷、黃芩素)可有效抑制生物被膜粘附階段來抑制金黃色葡萄球菌生物被膜生成，且黃芩素還能抑制生物被膜的agr系統。青蒿琥酯可抑制agr系統合成ɑ-溶血素，但不影響ica基因的表達[28]。許多中藥成分及植物提取物通過抑制生物被膜形成相關基因agr、ica、cid、sar等來減少生物被膜生成和粘附，例如冬凌草甲素[29]、大黃素[30]、茶樹精油[31]、大蒜素[32]、和人參皂苷[33]。小檗堿、胡椒堿和蕓香甙能夠結合外排泵和生物被膜形成的SasG G52-E2-G53靶點，對生物被膜的形成產生抑制作用[34]。此外，還有通過其他機制來抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的中藥成分及植物提取物，魚腥草水提物能下調cysM基因表達來干預半胱氨酸合成通路，抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成[35]；穿心蓮內酯可阻礙sarA蛋白二聚體的合成來抑制調控因子sarA，還可通過啟動細胞壁壓力響應機制(Cell wall stress stimulon, CWSS)，即引起細菌持續性高水平地合成細胞壁而不能及時清除廢舊的肽聚糖層，使細胞壁出現干燥、粗糙、散亂、不均勻增厚，導致難以維持滲透壓而崩解死亡，從而對生物被膜的產生進行雙重抑制[36]；葡萄籽油提取物通過影響金黃色葡萄球菌EPS產率和運動性抑制生物被膜的生成[37]。現將上述中藥成分及植物提取物整理見表1。

2.2 噬菌體 噬菌體是一種天然抗生物被膜劑，噬菌體可通過刺激宿主細菌產生EPS降解酶，分解細胞外基質中的蛋白質和多糖，促進噬菌體穿透、復制和消除存在于細胞內的細菌[38]。Jiang等[39]發現金黃色葡萄球菌噬菌體WV有較強的內溶酶活性，能夠刺激細菌產生EPS降解酶。噬菌體抑制奶源金黃色葡萄球菌生物被膜已在體外試驗被證實，Gharieb[40]等研究表明，vB-SauM-ME18和vB-SauM-ME126這兩個裂解噬菌體可抑制牛奶中多重耐藥金黃色葡萄球菌的生長和生物被膜的產生。阮紅日等[41]在含有金黃色葡萄球菌的牛乳中加入噬菌體vB-SauM-RS，作用48 h后生物被膜內細菌濃度降低了95.6%，且結晶紫染色顯示OD600nm由0.83降至0.36，表明vB-SauM-RS對生物被膜具有良好的清除效果。

表1 中藥及植物提取物對S. aureus生物被膜的作用機制Tab 1 Mechanism of action of traditional Chinese medicine and plant extracts on S. aureus biofilm

但在許多情況下，噬菌體并不能徹底消滅宿主細菌。Montaez-Izquierdo等[42]用噬菌體P100處理生物被膜8 h后解聚，但是48 h后浮游細菌仍然存活。有學者提出，使用噬菌體和噬菌體衍生產品與其他抗菌藥物(包括抗生素、納米顆粒和抗菌肽等)的聯合治療可能是去除生物被膜的有效方法[37]。

2.3 抗菌肽 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是廣泛存在于生物體內天然免疫系統中的一類小分子多肽，其抗菌譜廣、耐藥性低。研究發現，抗菌肽主要通過抑制細菌細胞的初始粘附和干擾生物被膜形成相關信號分子的表達(調節細菌生物被膜QS系統、抑制細菌的嚴謹應答反應、殺死生物被膜內的細菌細胞)來抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[43]。例如，抗菌肽(T-La(FS)、RGD-T-La(FS)、T-La(S)、RGD-T-La(S))能降低金黃色葡萄球菌生物被膜相關基因icaA、fib基因的轉錄水平、抑制生物被膜胞外蛋白合成與分泌[44]。蜂毒肽可以穿透金黃色葡萄球菌生物被膜的肽聚糖層，破壞生物被膜，抑制生物被膜產生[45]。蝎毒素抗菌肽La39的質量濃度在50 μg/mL時，作用8 h可有效地抑制金黃色葡萄球菌生長[46]。回麗媛在體外試驗中發現，抗菌肽17BIPHE2具有良好的抑制金黃色葡萄球菌生物被膜黏附、聚集作用，且能促進成熟生物被膜消散，17BIPHE2輔助抗生素抗生物被膜作用更好[47]。Alessandra等[48]發現，在抗菌肽HBD-2和HBD-3作用下，金黃色葡萄球菌的基因icaAD和生物被膜相關蛋白(Bap)顯著減少，生物被膜的形成被有效抑制。

2.4 生物表面活性物質 生物表面活性物質是微生物在代謝中分泌的一類既有親水基又含有疏水基的兩親性化合物，通過減少細胞表面疏水性、抑制電子傳遞鏈來改變細胞粘附能力，限制細胞的能量需求[49]。研究顯示，生物表面活性物質對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用，主要通過降低金黃色葡萄球菌生物被膜相關基因的表達和干擾群體感應系統中信號分子(AI-2)的釋放來實現。例如，Surfactin(一種由枯草芽孢桿菌產生的生物表面活性劑)，能降低生物被膜中堿溶性多糖的比例，顯著下調了icaA和icaD的表達，調節自體誘導物2(AI-2)的活性，從而影響金黃色葡萄球菌中的群體感應系統表達[50]。乳酸菌生物表面活性劑也被證實能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的產生，益生乳酸菌生物表面活性劑(BS)可通過調控cid操縱子、ica操縱子和agr調節系統來抑制金黃色葡萄球菌生物被膜相關基因表達，且乳酸菌BS對金黃色葡萄球菌QS系統的AI-2信號分子釋放具有抑制作用，影響QS系統[27]。Merghni等[51]試驗證明，金黃色葡萄球菌生物被膜形成48 h后，將其暴露于濃度為25 mg/mL的乳酸菌生物表面活性劑(BS-LBl和BS-LZ9)中，能顯著減少金黃色葡萄球菌生物被膜的擴散。Xin等[52]從乳酸片球菌和植物乳桿菌中提取的生物表面活性劑能夠影響生物被膜相關基因(cidA、icaA、dltB、agrA、sortaseA和sarA)的表達并干擾群體感應系統中信號分子(AI-2)的釋放，從而抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。Jiang等[53]研究表明，兩種來源于瑞士乳桿菌的生物表面活性劑都能降低金黃色葡萄球菌生物被膜相關基因的表達，并干擾群體感應系統中信號分子(AI-2)的釋放，且這兩種生物表面活性物質在體內外均具有抗粘附和抑制生物被膜形成的作用。此外，生物表面活性物質也可以通過膜介導的細胞凋亡和生物被膜破壞對金黃色葡萄球菌進行雙重抑制，Shu等[54]發現甘露糖基赤蘚糖醇脂質(MEL)通過此機制雙重抑制細菌粘附以去除生物被膜。

3 小結及展望

奶牛乳房炎嚴重制約著奶業的發展，影響奶牛健康和牛奶品質。以生物被膜形式存在的金黃色葡萄球菌使奶牛乳房炎反復發作，增加了奶牛乳房炎的防治難度。如何有效防治奶牛乳房炎是當前獸醫研究者面臨的一項重要任務，尋找安全、高效的抗生物被膜物質對防治奶牛乳房炎具有重要意義。

天然抗生物被膜物質與抗生素相比其優勢在于安全、高效、毒副作用小且不易引起耐藥性，因此成為當前的研究熱點。天然抗生物被膜物質已在體外實驗中表明其能有效減少金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，為防治金黃色葡萄球菌導致的奶牛乳房炎藥物的開發提供了新的思路。不同的天然抗生物被膜物質可抑制相同或作用相同的生物被膜形成相關基因，也可通過作用于生物被膜形成的相同階段抑制生物被膜的形成。未來，可以嘗試天然抗生物被膜物質之間聯用，以期產生協同或相加的效果。天然抗生物被膜物質與其他抗菌藥物(包括抗生素、納米顆粒等)聯合使用，研究針對奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌的抗生物被膜效果，或是防治奶牛乳房炎的一個新的研究方向。

迄今為止，對于金黃色葡萄球菌天然抗生物被膜物質的研究主要集中在體外研究。將來，我們可合理運用動物模型(例如：小鼠乳房炎模型等)，進一步研究天然抗生物被膜物質在體內的作用機制和作用靶點，并將這些發現與體外研究成果聯系起來，為天然抗生物被膜物質應用于金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎防治提供理論依據和數據支撐。