彝醫藥防疫古方的核心成分青蒿素和槲皮素抑制新冠病毒刺突蛋白的轉錄和翻譯

吳偉 吳俊汐 紀旭旭 劉戟 劉彬 耿福昌

摘要：目的 研究青蒿素和槲皮素單用或聯合使用是否可以通過抑制刺突蛋白（spike protein， S）的轉錄和翻譯來治療新冠病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）。方法 采用梯度濃度的青蒿素或槲皮素處理Vero E6細胞，進行細胞活力測定；采用新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）的S基因質粒轉染Vero E6細胞，而后采用青蒿素或槲皮素單獨或聯合處理，以檢測S蛋白的基因轉錄和蛋白質翻譯水平。結果 青蒿素或槲皮素處理可以顯著降低SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的mRNA和蛋白表達水平，差異具有統計學意義（P<0.01， P<0.05），并且，20 ?mol/L或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯合用藥比單獨用藥能夠更為顯著地降低S蛋白的蛋白表達水平，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 單獨和聯合使用青蒿素和槲皮素均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因轉錄和蛋白翻譯。

關鍵詞：青蒿素；槲皮素；SARS-CoV-2；刺突蛋白；轉染；基因轉錄；蛋白翻譯；彝族藥物

中圖分類號：R966文獻標志碼：A

Artemisinin and quercetin， the core components of the ancient prescriptions for epidemic prevention of Yi medicine， inhibit the transcription and translation of SARS-COV-2 spike protein

Wu Wei1，2，3.4， Wu Junxi5， Ji Xuxu3， Liu Ji3， Liu Bin2， and Geng Fuchang2

（1 Research Institute of Medicine and Herbs of Yi Nationality & Gastroenterology Department， Liangshan Prefecture Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Xichang 615000; 2 Good Doctor Pharmaceutical Group Co.，Ltd. Chengdu 610073; 3 Department of Biochemistry and Molecular Biology， West China School of Basic Medical Science and Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041; 4 Remeadjohn Technology Co.， Ltd.， Chengdu 610044; 5 School of Medical and Life Science， Chengdu University of TCM， Chengdu 610000）

Abstract Objective To investigate whether the single or combined treatments with artemisinin and quercetin can improve corona virus disease 2019 （COVID-19） via inhibiting the transcription and translation of spike protein （S）. Methods Vero E6 cells were treated with artemisinin or quercetin in gradient concentration， and the cell viability was determined. Vero E6 cells were transfected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS CoV-2） S gene plasmid， and then treated with artemisinin or quercetin alone or combined to detect the level of the gene transcription and protein translation of S protein. Results The treatments with artemisinin or quercetin could significantly reduce the expression levels of mRNA and protein of S protein in Vero-E6 cells after transfected with SARS CoV-2 S gene plasmid， and the difference was statistically significant（P<0.01， P<0.05）. In addition， the combined treatment of 20 or 200 ?mol/L artemisinin and 50 ?g/mL quercetin could significantly more decreased the protein expression level of S protein compared to the single treatments， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The single or combined treatments with artemisinin and quercetin can effectively inhibit the gene transcription and protein translation of SARS-CoV-2 S protein.

Key words Artemisinin; Quereetin; SARS-CoV-2; Spike protein; Transfection; Gene transcription; Protein translation; Medicine and Herbs of Yi Nationality

世界衛生組織于2023年2月發布的最新數據表明，由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引發的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）大流行已在全球范圍內造成7.55億確診病例感染，680多萬死亡[1]。目前，SARS-CoV-2已衍生出多種變體，包括奧密克戎變體，它是一種嚴重變異的病毒，具有極高的感染風險[2]。目前的新型冠狀病毒感染疫苗能否有效預防這些新菌株仍在調查中[3]。鑒于此，一些國家在預防和抗擊新型冠狀病毒感染的健康指南中也納入了替代療法[4]。天然產物中的化合物具有廣泛的生物和治療特性，對新型冠狀病毒感染具有潛在的預防和治療作用[5]。尋求有效且容易獲得的天然產品或化合物作為新型冠狀病毒感染的替代和補充藥物，可能有助于降低發病率、住院率、疾病嚴重程度和死亡率。

新冠病毒進入細胞由病毒表面錨定的刺突蛋白（S蛋白）介導，該蛋白具有明顯的β屬冠狀病毒S蛋白特性，S1亞基發揮與受體識別和結合的功能，S2亞基參與膜融合過程[6]。冠狀病毒進入宿主細胞是病毒感染性和發病機制的重要決定因素，也是宿主免疫監視的主要目標[7]。因此，S蛋白成為了臨床治療新冠病毒感染藥物以及疫苗研制傾向選擇的靶點。

據彝醫藥古籍《聶蘇諾期》記載，中國有一種古老的彝族醫藥防疫藥方。彝族醫藥采用該熏蒸法防治流行性傳染病，至今仍經常使用[8]。該方劑主要藥材是青蒿（ARTEMIAE ANNUAE HERBA）和側柏葉（PLATYCLADI CACUMEN）。青蒿素 （artemisinin， A） 是青蒿中一種具有過氧化物部分的倍半萜內酯[9]，研究發現青蒿素在Vero E6細胞中測定的預處理或后處理抗SARS-CoV-2測定中顯示出優異的效果（選擇性指數分別為35或54）[10]。槲皮素 （quercetin， Q） 是側柏葉中的一種黃酮類化合物，經常用作檢測6種黃酮類化合物的內部參照物[11]。研究發現槲皮素在VeroE6細胞中測定的抗SARS-CoV-2測定中也顯示出良好的效果（選擇性指數=39.81）[12]。

綜上，本文旨在研究青蒿素和槲皮素單用或聯合使用是否可以通過抑制S蛋白的轉錄和翻譯來減輕新冠病毒感染癥狀。

1 實驗材料與方法

1.1 細胞、藥品和試劑

Vero E6非洲綠猴腎細胞購自北納創聯生物技術有限公司；青蒿素購自北京索萊寶科技有限公司；槲皮素購自上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購于美國Bimake生物科技有限公司；GAPDH單克隆鼠抗和SARS-CoV-2 spike protein單克隆鼠抗購自Cell signaling公司；SARS-CoV-2 S基因質粒和pUC57質粒購于北京擎科生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒、HisScript? III 1st Strand cDNA合成試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購于南京諾唯贊醫療科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、雙色SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、蛋白酶抑制劑PMSF、DEPC水（DNase、RNase free）、Lipo6000?轉染試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；NEWZERUM標準級胎牛血清購于新西蘭Newzerum公司；逆轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia。

1.2 細胞培養

將含有1 mL Vero E6細胞懸液凍存管在37℃水浴中快速搖晃解凍，加4 mL含10%FBS的DMEM培養基混合均勻；在1000 r/min條件下離心4 min，棄去上清液，加1～2 mL培養基后用槍輕輕吹打混勻；將Vero E6細胞接種至細胞培養板， 在37 ℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養過夜；Vero E6細胞密度達80%～90%，即可進行傳代培養。

1.3 質粒轉染

將pUC57質粒轉染設為NC組，SARS-CoV-2 S基因質粒設為SARS-COV-2 S組。轉染前1～2 d，將細胞以適宜密度接種到96孔板內培養至細胞密度達到約70%～90%；將孔內培養基更換為新鮮含10%FBS的DMEM培養基；取兩個潔凈無菌離心管，分別加入對應體積無血清DMEM培養基，然后于其中一管加入質粒DNA，另一管加入Lipo6000?轉染試劑，并用槍輕輕吹打混勻；室溫靜置5 min后，將含有質粒DNA的培養液用槍輕輕加入含Lipo6000?轉染試劑的培養液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻；室溫靜置5 min后，均勻滴加到整個孔內，隨后輕輕混勻；繼續培養約24～48 h后，提取RNA及蛋白檢測轉染效果。

1.4 細胞活力測定

將細胞以適宜密度接種到96孔板內培養至細胞密度達到約70%～90%；吸出96孔板孔內的培養基，加入適量PBS清洗細胞；而后使用無血清DMEM培養基和CCK8溶液配置反應液（比例為10：1），混合均勻后，每孔加入100 μL反應液，并設置空白未鋪細胞對照孔加入100 μL反應液，放置于37 ℃和5%CO2恒溫箱內孵育1 h；在450 nm處測量吸光度。

1.5 Western Blot

從pUC57質粒和SARS-CoV-2 S基因質粒轉染的Vero E6細胞中提取所有蛋白。使用BCA試劑定量蛋白質裂解物。蛋白質通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS–PAGE）分離，轉移到硝化纖維素膜（0.45 μm NC）上，然后室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃下用特異性一級抗體進行免疫印跡過夜，使用HRP結合的二級抗體在室溫下孵育1 h。使用高靈敏度ECL化學發光檢測試劑盒檢測蛋白質條帶。

1.6 qPCR檢測S-蛋白基因表達

使用TRIzol從pUC57質粒和SARS-CoV-2 S基因質粒轉染的Vero E6細胞中提取RNA。采用逆轉錄試劑盒，根據說明書進行逆轉錄。用Primer BLAST軟件設計S蛋白的特異性正向和反向引物，參見表1。而后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行絕對定量分析。數據顯示為對照組的平均折疊變化。

1.7 數據分析

所有統計學分析均通過GraphPad Prism 7.0進行，計量資料以（x±s）兩組比較均采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 結果與分析

2.1 青蒿素與槲皮素對Vero E6細胞活力的影響

采用青蒿素（0、5、10、20、50、100、150、200、300、500 ?mol/L）和槲皮素（0、3、5、6.25、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）分別與Vero E6細胞在7 ℃、體積分數為5% CO2的培養條件下共孵育24 h，而后使用CCK8檢測細胞活性。如圖1所示，結果如下，與對照組（0 ?moL/L的青蒿素或0 ?g/mL的槲皮素）比較，青蒿素在小于500 ?moL/L的濃度范圍內以及槲皮素在小于200 ?g/mL的濃度范圍內并不能誘導Vero E6細胞細胞活力的顯著性下降（P>0.05）。青蒿素在小于500 ?moL/L的濃度范圍內以及槲皮素在小于200 ?g/mL的濃度范圍內對Vero E6細胞無明顯的細胞毒性。

2.2 質粒轉染對Vero E6細胞毒性作用

將預先鋪設在96孔板中的Vero E6細胞分為4組：①對照組; ②Lipo6000?組（Lipo6000?轉染試劑）; ③NC組（pUC57質粒轉染）; ④SARS-CoV-2 S組（SARS-CoV-2 S基因質粒轉染），使用CCK8檢測細胞活力。結果如下，與對照組比較，Lipo6000?組、NC組和SARS-CoV-2 S組的細胞活力無顯著性差異（P>0.05），參見圖2，證明pUC57質粒和SARS-CoV-2 S基因質粒轉染以及Lipo6000?轉染試劑對Vero E6細胞無明顯的細胞毒性。

2.3 SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的mRNA和蛋白表達

將預先鋪設在96孔板中的Vero E6細胞分為2組：NC組（pUC57質粒轉染）和SARS-CoV-2 S組（SARS-CoV-2 S基因質粒轉染）。轉染24 h后，分別提取細胞RNA和蛋白，采用qPCR和Western Blot檢測mRNA與蛋白的表達水平變化。結果表明，與NC組比較，SARS-CoV-2 S組的S蛋白mRNA表達水平增加了4.8倍（P<0.01），蛋白表達水平增加了2.7倍（P<0.001），參見圖3，證明質粒轉染成功且能在Vero E6細胞中順利表達。

2.4 青蒿素或槲皮素單獨使用對SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的mRNA和蛋白表達的抑制作用

為研究青蒿素對SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的mRNA和蛋白表達的抑制作用，實施步驟如下：①將SARS-CoV-2 S基因質粒轉染到鋪設于96孔板中的Vero E6細胞中；②將細胞隨機分為6組：對照組（青蒿素0 ?mol/L濃度組）、青蒿素5 ?mol/L濃度組、青蒿素20 ?mol/L濃度組、青蒿素50 ?mol/L濃度組、青蒿素100 ?mol/L濃度組和青蒿素200 ?mol/L濃度組；③將步驟B設定的處理藥物分別加入孔內與細胞共孵育24 h；④提取細胞RNA和蛋白，并進行qPCR和Western Blot檢測。

結果表明：①與對照組比較，其他濃度組的青蒿素均誘導了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達水平顯著性下調（P<0.05，P<0.01）；②與5、50和100 ?mol/L濃度組比較，20和200 ?mol/L濃度的青蒿素能夠更為顯著地誘導SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達水平下調（P<0.05），抑制率達到80%；③與對照組比較，20和200?mol/L濃度的青蒿素誘導了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表達水平的顯著性下調（P<0.05）。

為研究槲皮素對SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的mRNA和蛋白表達的抑制作用，將細胞隨機分為6組：①對照組（槲皮素0濃度組）， ②槲皮素6.25 ?g/mL濃度組， ③槲皮素12.5 ?g/mL濃度組， ④槲皮素25 ?g/mL濃度組， ⑤槲皮素50 ?g/mL濃度組， ⑥槲皮素100 ?g/mL濃度組；其他實施步驟參照“2.4”。結果如下：①與對照組比較，除12.5 ?g/mL濃度組外，其他濃度組的槲皮素均誘導了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達水平的顯著性下調（P<0.05，P<0.01）；②與6.25、25和100 ?g/mL濃度組比較，50 ?g/mL濃度的槲皮素能夠更為顯著地誘導SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達水平下調（P<0.05），抑制率達到60%；③與對照組比較，50 ?g/mL濃度的槲皮素誘導了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表達水平的顯著性下調（P<0.001）。

2.5 青蒿素與槲皮素聯合用藥與單獨用藥對SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的蛋白表達的抑制作用比較

為探討青蒿素與槲皮素聯合用藥與單獨用藥對SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的蛋白表達的抑制作用比較，步驟如下：①根據本研究“2.4”部分的研究結果，選擇20、200 ?mol/L濃度的青蒿素及50 ?g/mL濃度的槲皮素作為干預藥物；②將SARS-CoV-2 S基因質粒轉染到鋪設于96孔板中的Vero E6細胞中；③將細胞隨機分為6組：對照組（青蒿素和槲皮素濃度均為0）、青蒿素（20 ?mol/L）組、青蒿素（200 ?mol/L）組、槲皮素（50 ?g/mL）組、青蒿素（20 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）組、青蒿素（200 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）組；④將步驟C設定的干預藥物分別加入孔內與細胞共孵育24 h；⑤提取細胞蛋白，進行Western Blot檢測。

結果如下：①與對照組比較，其他各組的S蛋白的蛋白表達水平均顯著下調（P<0.05）；②20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯合用藥比單獨用藥能夠更為顯著地下調S蛋白的蛋白表達水平（P<0.05），參見圖6， 證明20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯合用藥比單獨用藥能夠更為有效地抑制SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后Vero E6細胞內S蛋白的蛋白表達。

3 討論

有效地控制新冠病毒基因組在宿主細胞內的復制表達過程，是控制新冠病毒傳播的重要環節[13]。研究發現青蒿素（<500 ?mol/L）和槲皮素（<200 ?g/mL）以及SARS-CoV-2 S基因質粒轉染對Vero E6細胞無細胞毒性作用。SARS-CoV-2 S基因質粒轉染后，S蛋白的基因在Vero E6細胞內成功地進行了基因轉錄和蛋白翻譯。而后，使用彝藥防疫古方的核心組分青蒿素和槲皮素對轉染SARS-CoV-2 S基因質粒后的細胞進行處理，發現青蒿素與槲皮素單獨用藥在部分濃度對S蛋白的基因表達和蛋白翻譯有著顯著的抑制作用，且20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯合用藥的抑制效果顯著優于單獨用藥。以上證據表明：彝藥防疫古方的核心組分青蒿素和槲皮素單獨和聯合使用均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因轉錄和蛋白翻譯。

參 考 文 獻

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