利福平致小鼠非酒精性脂肪性肝炎作用機理研究

曾青山 趙豐娟 張莉 王淳 李曉媛 杜仕靜 華曉萍 黃利 張媛 譚正懷

摘要：目的 利福平為一線抗結核藥物，可誘導非酒精性脂肪性肝炎（NASH），但其相關作用機理有待進一步闡明。

方法 幼年小鼠在出生后第二天皮下注射谷氨酸鈉（monosodium glutamate， MSG）5 g/kg以誘導肥胖、胰島素抵抗的肥胖小鼠，用于考察利福平致小鼠NASH與胰島素抵抗的相關性；采用靜脈注射氯膦酸脂質體剔除小鼠肝臟Kupffer細胞，觀察Kupffer細胞在利福平致小鼠NASH中的作用。結果 MSG小鼠在50 d齡時明顯肥胖，Lees指數顯著增加，肝臟脂質輕度堆積、肝功能輕度受損，肝臟組織病理出現輕微的炎癥反應。連續灌胃利福平600、300和150 mg/kg 7 d可引起正常小鼠和肥胖小鼠肝功能受損，肝臟發生NASH樣病理改變，對肥胖小鼠的作用明顯強于正常小鼠。注射脂質體剔除肝臟Kupffer細胞小鼠體重降低并伴隨著輕微的肝損傷，但未影響肝臟中TG和TC的含量；利福平可使Kupffer細胞剔除小鼠可使其體重降低，肝臟發生NASH樣改變，但與正常小鼠相比并無明顯差異。結論 研究結果表明利福平所致小鼠肝臟NASH變化與胰島素抵抗及肝臟脂質堆積程度、肝組織功能狀態密切相關，這些作用與Kupffer細胞無明顯關聯，提示利福平在臨床用于結核病治療時應加強檢測患者肝功能及脂肪肝，有利于預防利福平所致的肝損傷。

關鍵詞：利福平；胰島素抵抗；小鼠；Kupffer細胞；氯膦酸脂質體；非酒精性脂肪性肝炎

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Study on the mechanism of rifampicin induced non-alcoholic steatohepatitis in mice

Zeng? Qingshan1，2， Zhao? Fengjuan2，3， Zhang Li2， Wang Chun1，2， Li Xiaoyuan2，

Du Shijing2， Hua Xiaoping2， Huang Li2， Zhang Yuan2， and Tan Zhenghuai2

（1 Chengdu University of Traditionnal Chinese Medicine， Chengdu 610072; 2 Sichuan Academy of Chinese Medicine Science， Chengdu 610041; 3 Southwest Medical University， Luzhou 646000）

Abstract Objective Rifampicin is a first-line anti-tuberculosis drug， which can induce non-alcoholic steatohepatitis（NASH）， but its mechanism remains to be further elucidated. Methods Juvenile mice were injected subcutaneously with monosodium glutamate （MSG） 5 g/kg on the second day after birth to induce obese and insulin-resistant obese mice， for examining the correlation between rifampicin-induced NASH and insulin resistance. the role of Kupffer cells in rifampicin-induced NASH in mice was observed using intravenous clodronate liposome excision of mouse liver Kupffer cells. Results At the age of 50 days， MSG mice were significantly obese， with a significant increase in Lees index， mild accumulation of liver lipids， mildly impaired liver function， and the liver pathology showed slight inflammatory reaction. Continuous gavage of rifampicin at 600， 300 and 150 mg/kg for 7 days could cause liver function damage and Nash-like pathological changes in the liver of normal and obese mice， and the effect on obese mice was significantly stronger than that in normal mice. Mice which Liposome knockout Kupffer cell decreased body weight and accompanied with mild liver injury， but did not affect the contents of TG and TC in the liver. Rifampicin could reduce body weight and NASH-like changes in the liver of Kupffer cell mice， but there was no significant difference compared with normal mice. Conclusion The results showed that the changes of liver NASH in mice caused by rifampicin were closely related to insulin resistance and the degree of hepatic lipid accumulation and functional status of liver tissues， and these effects were not significantly associated with Kupffer cells， It is suggested that rifampicin should be strengthened to detection of liver function and fatty liver when used clinically for tuberculosis treatment， which is beneficial to prevent rifampicin-induced liver injury.

Key words Rifampicin; Insulin resistance; Mice， Kupffer cells; Clodronate liposomes; Non-alcoholic steatohepatitis

據世界衛生組織估計，每年因結核病死亡的人數達到數百萬，中國、印度是重災區；近年來，我國因結核病死亡的人數在80萬～120萬，其主要流行病株為耐利福平菌株[1]。利福平（rifampicin，RFP）為利福霉素B衍生物，是抗結核一線藥物，但長期大劑量服用可引起嚴重肝損傷，嚴重者不得不中斷治療，后者可引起耐藥菌株出現[2-3]。前期本項目研究發現短期、大劑量給予利福平即可誘導肝損傷，肝臟發生明顯的脂肪變，甚至發展成非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[4]，但其作用機理還沒有完全闡明。

NASH是非酒精性脂肪性肝病 （ nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 從脂肪變性發展到肝纖維化的進展階段，主要病理特征表現為肝臟脂肪過度堆積、肝臟炎癥，可伴有纖維化[5]。據統計，NAFLD發病率大多在25%以上[6]。從NAFLD發展到NASH的機理至今沒有得到系統闡明。早期“二次”打擊學說（two-hit hypothesis）認為胰島素抵抗（IR）在NASH的發生、發展中起著非常重要的作用 [7]。但近年學術界更為認同多種平行打擊假說（The multiple parallel hits hypothesis）：炎癥可以促進脂肪肝的形成，NASH反應了一種緊跟在炎癥之后的脂肪肝性疾病，也可能NAFL是抗脂毒性失敗的結果[8]。

胰島素抵抗與三大物質代謝密切相關，但胰島素抵抗是否參與了利福平致小鼠脂肪肝作用，目前未見相關報道。在小鼠出生時，皮下注射適量谷氨酸鈉損傷大腦弓狀核攝食中樞及產熱中樞，可誘導小鼠產生代謝紊亂，逐漸肥胖并出現胰島素抵抗[9]。為此，本文擬比較研究利福平致正常小鼠和肥胖小鼠NASH作用，以希從中闡明肝臟脂質堆積以及胰島素抵抗在NASH發生、發展中的重要作用。

肝臟Kupffer細胞作為人體中最大的巨噬細胞儲存庫，在肝臟炎癥以及纖維化形成中發揮著重要作用，但是否參與了利福平誘導小鼠NASH，目前還未見相關報道。為此，本文采用靜脈注射氯磷酸鈉脂質體以定向清除肝臟中的Kupffer細胞，以期發現Kupffer細胞在利福平誘導NASH中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物和試劑

一水L-谷氨酸鈉，批號20191008，BR（國藥集團化學試劑有限公司），用生理鹽水配制成所需濃度的溶液備用；利福平，膠囊劑，每粒0.15 g，批號211010（成都錦華藥業有限責任公司），臨用前將膠囊中粉末倒出研磨后，加入0.5% CMC-Na配制至相應濃度；生理鹽水，批號B20093704（四川科倫藥業股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），批號2014102701，AR（成都市科龍化工試劑廠），臨用前用超純水配制成0.5%濃度的溶液備用；氯膦酸脂質體，SKU：C-105，濃度 5 mg/mL，規格 15 mL，批號 2022446（荷蘭 Liposoma BV公司）。

1.2 生化檢測試劑盒

肝組織檢測：甘油三酯測定試劑盒（GPO-PAP法），批號2022001；膽固醇測定試劑盒（CHOD-PAP法），批號2022001（長春匯力生物有限公司）。

用于血清檢測：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒，批號0522022；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測定試劑盒，批號0322012；甘油三酯（TG）測定試劑盒，批號0122011；膽固醇（TC）測定試劑盒，批號1021031；總膽汁酸（TBA）測定試劑盒，批號1021041；直接膽紅素（DBIL）測定試劑盒，批號0222012；總膽紅素（TBIL）測定試劑盒，批號0222012；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒，批號1121041；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒，批號042031。以上試劑盒均購自新健康成生物股份有限公司。

1.3 實驗儀器

電子天平（JA1003A，d=1 mg，e=10 d，上海龍騰電子儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（TST101A-1B，成都特思特儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機（TGL-16，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；多功能酶標儀（Varioskan Flash ，美國Thermo公司）；全自動生化分析儀（日立7180型，日本株式會日立高新技術）。

1.4 動物及環境

SPF級昆明種小鼠，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（川）-2018-19，用于肥胖小鼠培育實驗；由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號為SCXK（湘）-2019-0004，用于Kupffer細胞缺乏實驗。動物飼養于四川省中醫藥科學院實驗動物中心屏障系統中，合格證號：SYXK（川）-2018-100，室溫22 ℃～25 ℃，濕度50%±5%，明、暗各12 h，試驗期間小鼠自由攝食和飲水。

1.5 方法

1.5.1 利福平誘導肥胖小鼠NASH作用研究

從乳鼠出生開始計為第1天，從第2天開始，一組乳鼠頸后皮下注射谷氨酸鈉5 g/kg，另一組乳鼠頸后皮下注射生理鹽水，注射體積均為0.2 mL/10 g。

隔天一次，連續給藥3次。6～8周齡時用于實驗研究。取正常小鼠，雌雄兼用，隨機分為對照組、利福平600、300和150 mg/kg等實驗組，每組數量分別為10、9、9和9只。另取肥胖小鼠，雌雄兼用，隨機分為肥胖對照組、利福平600、300和150 mg/kg

等實驗組，每組數量分別為10、9、9和10只。分別灌胃藥物或等體積0.5%CMC-Na，1次/d，連續7 d。末次給藥24 h并禁食不禁水16 h后，取血分離血清測谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、甘油三酯（triglyceride， TG）、 總膽固醇（serum total cholesterol， TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol， HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteins cholesterol， LDL-C）、總膽汁酸（total bile acid， TBA）、總膽紅素（total bilirubin， TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin， DBIL）水平； 取肝臟稱濕重并計算其臟器指數，取部分肝臟組織置于-80 ℃冰箱中用于測定其 TC和TG含量。取肝大葉用10%甲醛固定進行組織病理學觀察。

1.5.2 利福平誘導肝Kupffer細胞缺失小鼠NASH作用研究

選取體重為18～20 g的雄性KM小鼠，隨機分為對照組、利福平300 mg/kg、脂質體、利福平300 mg/kg加脂質體，每組數量分別為10、8、9和9只。在實驗開始第1天和第4天，各組動物分別靜脈注射氯膦酸脂質體0.1 mL/10 g或等體積生理鹽水。在第一次注射24 h后，分別灌胃藥物或等體積0.5%

CMC-Na，1 次/d，連續7 d，末次給藥后24 h并禁食不禁水16 h取血分離血清測ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、TBA、TBIL和DBIL的水平；取肝稱濕重并計算臟器指數，取部分肝組織測TG和TC，另取肝大葉置于福爾馬林中固定后進行組織學觀察。

1.5.3 肝臟組織病理學評分

肝臟組織經10%福爾馬林充分固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋，制成3～5 μm病理切片，在光學顯微鏡下觀察動物肝臟結構。參考文獻[10]并結合本實驗實際情況，擬定“肝細胞壞死”和“肝細胞脂肪變性”為觀測指標。病變程度采用半定量分析[11]。

1.5.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，數據采用x±s表示，比較采用t檢驗和析因分析。

2 結果

2.1 利福平對正常小鼠和肥胖小鼠肝指數和肝臟脂質的影響

肥胖小鼠在給予利福平600 mg/kg 3次后死亡了2只動物，其余各組動物在實驗期間均未發生死亡。

由表1可見，肥胖小鼠Lees指數明顯增加，肝臟指數有所減少，但肝臟脂質含量有所增加，利福平各劑量組均可程度相似地降低正常和肥胖小鼠體重，增加其肝臟脂質以及肝臟指數，其中利福平300和150 mg/kg增加肥胖小鼠肝臟TG的作用明顯強于對正常小鼠的作用。與正常對照小鼠相比，肥胖小鼠各給藥組小鼠Lee's指數、肝臟指數、肝臟TC和TG均明顯增加，存在統計學差異。

2.2 利福平對正常小鼠和肥胖小鼠肝臟功能的影響

由表2可知，肥胖小鼠血清ALT水平升高，與正常小鼠比較差異具有統計學意義。利福平各劑量組均可損傷正常小鼠和肥胖小鼠肝臟功能，使其血清ALT、AST、TBIL、DBIL和TBA水平均顯著升高，與各自的對照組存在明顯的統計學差異。其中利福平300和150 mg/kg對肥胖小鼠的作用明顯嚴重于正常對照組，組間比較差異具有統計學意義。

2.3 利福平對正常小鼠和肥胖小鼠血脂水平的影響

由表3可知，肥胖小鼠血清TG和LDL水平降低，TG/HDL比值降低，與正常小鼠比較差異具有統計學意義。利福平600 mg/kg可引起正常小鼠和肥胖小鼠血清TC、HDL和VLDL水平均降低，與各自的對照組存在明顯差異。利福平150 mg/kg卻可升高正常小鼠和肥胖小鼠血清TC、HDL、LDL和VLDL水平，與各自的對照組存在明顯差異。

2.4 利福平對正常小鼠和肥胖小鼠肝臟病理組織學的影響

在顯微鏡下觀察發現，對照組肝組織結構正常，肥胖組動物存在肝細胞輕度脂肪變性、少量肝細胞點狀壞死伴炎細胞浸潤，各給藥組均可引起小鼠肝臟組織發生脂肪變性和肝細胞壞死，利福平對小鼠肝臟的損傷呈明顯的劑量依賴性，相同劑量的利福平對肥胖小鼠肝臟的損傷作用明顯強于正常小鼠（圖1和表4）。

2.5 利福平與動物體質狀態交互作用分析

從表5方差分析結果可以看出，肥胖小鼠在體重、肥胖指數、肝臟TG水平、血清ALT、TBIL、DBIL、TG、LDL以及TG/HDL水平起主要作用；利福平在肝臟指數、肝臟TC及TG水平、血清ALT、TBIL、DBIL、TBA、TC、HDL、LDL以及VLDL水平起主要作用；肥胖小鼠與利福平在肝臟指數、血清TBIL、DBIL水平存在明顯的交互作用；而在肝臟TG水平、血清ALT水平存在明顯的相加作用。

2.6 利福平對Kupffer細胞缺乏小鼠肝指數及肝臟脂質的影響

由表6可見，在注射脂質體、灌胃利福平，脂質體與利福平聯用后，小鼠體重明顯下降，與對照組比較差異具有統計學意義。灌胃利福平，可引起正常小鼠以及Kupffer細胞缺乏小鼠的小鼠肝指數、肝臟中的TG和TC明顯升高，與對照組相比存在明顯的差異。靜脈注射脂質體引起小鼠Kupffer細胞缺乏對小鼠的肝臟指數、肝臟脂質均無明顯影響，與對照組比較差異無統計學意義。

2.7 利福平對Kupffer細胞缺乏小鼠肝臟功能的影響

由表7可知，給藥利福平1周后，小鼠ALT、AST、TBil、DBil和TBA含量均明顯上升；靜脈注射脂質體兩次后，ATL、AST和TBA含量顯著上升，DBil含量下降；脂質體和利福平聯用后，小鼠ALT、AST、TBil、DBil和TBA含量均明顯上升；與對照組比較差異具有統計學意義。

2.8 利福平對Kupffer細胞缺乏小鼠血脂水平的影響

由表8可知，給藥利福平一周后，小鼠血清中TC含量和VLDL下降，LDL上升；靜脈注射脂質體兩次后，血清中TC、HDL和LDL含量顯著上升，脂質體和利福平聯用后，血清中LDL含量上升；與對照組比較差異具有統計學意義。

2.9 利福平對Kupffer細胞缺乏小鼠肝臟組織病理學的影響

小鼠灌胃利福平7 d后，可誘導肝細胞脂肪變性。小鼠尾靜脈注射氯膦酸脂質體，可誘導輕度的肝細胞壞死伴炎細胞浸潤。小鼠尾靜脈注射氯膦酸脂質體后再給予利福平7 d，未見明確的肝細胞壞死，但肝細胞脂肪變性較單用利福平稍有加重。各組切片觀察具體結果如圖2。

2.10 利福平和脂質體對小鼠的交互作用分析

從表10方差分析結果可以看出，脂質體在小鼠體重、ALT、AST以及血脂水平變化起主要作用；而利福平在小鼠血脂TC、HDL以及VLDL水平、小鼠體重、肝臟指數、肝臟TG以及TC、肝臟功能指標上均起主要作用；脂質體與利福平在小鼠血清TG以及TG/HDL比值變化上存在明顯的交互作用。

3 討論

NASH的發病機理至今沒有得到系統闡明，盡管NASH患者以肥胖者居多，但仍有大約25%的患者為“瘦子”；同樣肝臟脂肪堆積以及血脂水平提高，在NASH的發生、發展中作用和地位所起的作用如何，至今無定論。本研究發現：初生小鼠皮下注射谷氨酸鈉后50 d，其體型變得肥胖，Lees指數顯著增加，其血清TG及LDL水平顯著低于同年齡正常小鼠，肥胖小鼠肝臟少量肝細胞輕度脂肪變性、少量肝細胞點狀壞死伴炎細胞浸潤，肝臟生化檢測發現其TG、TC含量顯著增加，但其血中TG水平降低，TG/HDL比值顯著降低，肝功能受損，肝臟處理TG的能力顯著下降。利福平大劑量可引起小鼠血清脂質（TG和TC）降低（對正常小鼠或肥胖小鼠），顯著增加肝臟脂質特別是TG水平，肝臟組織及功能受損，對肥胖動物的作用明顯強于正常小鼠，在利福平300 mg/kg表現最為明顯（高劑量的敏感性可能與其有動物死亡有關），說明胰島素抵抗以及肝臟脂肪堆積在利福平所致NASH中發揮了重要作用。

Kupffer細胞作為人體中最大的巨噬細胞儲存庫，當肝臟受損傷時，Kupffer細胞活化，具有吞噬活性并分泌促炎癥細胞因子和活性氧，致使肝臟形成最早的肝臟脂質沉積和肝損傷。因此耗竭Kupffer細胞可引起炎癥細胞因子的表達減少，炎癥和肝細胞死亡（壞死性炎癥）減弱[12]。但在一項對喂養高脂奶粉的小鼠的研究中，Kupffer細胞的耗竭減少肝臟內前列腺素E2（PGE2）的釋放，減弱了對胰島素的反應，導致肝臟脂質合成增加，增強了肝臟中脂肪的含量[13]。

氯膦酸鹽（Cl2MBP）是一種親水性分子，當氯膦酸鹽包裹在脂質體中時，巨噬細胞通過胞吞攝取脂質體，隨后在磷脂酶介導下破壞脂質體雙層，并在細胞內釋放C12MDP，將不可逆地損傷誘導巨噬細胞凋亡[14]。

本次實驗中，有兩只肥胖小鼠在灌胃利福平600 mg/kg3次后出現死亡，解剖后發現氣管、胃和肺組織均未出現損傷，但肝組織存在嚴重的損傷效果。后期其他同組動物血清和切片檢測也發現利福平600 mg/kg組小鼠存在嚴重肝損傷，ALT和AST含量遠高于肥胖小鼠其他給藥組，推測死亡小鼠可能是肝損傷過于嚴重，加上多次給藥加重了損傷效果導致了死亡，提示利福平對肥胖動物的敏感性高于正常小鼠，與肝損傷結果一致，可進一步佐證研究結論。

本文研究發現注射氯膦酸脂質體后，小鼠體重下降，其血清ALT、AST和TBA水平顯著升高，肝組織炎癥反應加重，但對肝臟中脂質含量無影響，提示注射氯膦酸脂質體這種剔除Kupffer細胞的方法會對肝組織以及功能造成一定的影響，但沒有參與NASH早期階段的發生和發展；利福平用于Kupffer細胞剔除小鼠，同樣會引起肝臟發生相似程度的NASH樣改變，且其程度有明顯加重的趨勢，這種作用趨勢可能與氯膦酸脂質體清除Kupffer細胞所引起的肝損傷有關，也表明利福平致小鼠NASH變化與肝臟Kupffer細胞無明顯關聯。

綜上所述，利福平所致NASH作用與胰島素抵抗、肝臟脂質堆積程度密切相關，與肝組織功能狀態密切相關，但與Kupffer細胞無明顯關聯。提示利福平在臨床用于結核病治療時應增加檢測患者肝功能以及脂肪肝，對于預防利福平所致的肝損傷具有重要的參考價值。

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