基于p38 MAPK信號通路探討穴位埋線對哮喘大鼠肺組織Th1/Th2失衡及EOS的影響?

唐徐韻，陳盼碧△，杜狄佳，秦中銀，龍潤錦

(1.貴州中醫藥大學針灸推拿學院，貴陽 550025；2.織金縣中醫院，貴州 織金 552100)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統的常見病、多發病，以持續性的慢性氣道炎癥為特征[1]，其中嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)是哮喘氣道炎癥最重要的效應細胞之一。當EOS在氣道周圍募集、活化時，會釋放出具有細胞毒性的蛋白顆粒，并合成炎性介質和細胞因子，從而引起氣道炎癥的發生。同時在哮喘的免疫學發病機制中，Th1/Th2免疫失衡同樣是引起哮喘發病的重要原因。Th2所分泌的細胞因子白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等可以增強內皮細胞對EOS的黏附并影響EOS的活化，促進EOS在局部的浸潤而引發氣道炎癥，而Th1分泌的細胞因子γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等則可以拮抗IL-4的作用，減輕炎癥細胞浸潤[2,3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是生物體內重要的信號傳導系統之一，p38 MAPK信號通路可能是哮喘Th1/Th2免疫失衡發病機制的核心調控通路。研究表明，可以通過抑制磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表達，從而抑制p38 MAPK的信號傳導，調節Th1/Th2類細胞因子，糾正Th1/Th2的免疫失衡[4-6]。

課題組前期研究發現，穴位埋線可以通過降低哮喘大鼠血清中IL-4的表達，升高IFN-γ的表達，從而起到防治哮喘的作用[7]。基于此，本實驗在前期研究基礎上進一步深入探討穴位埋線是否通過p38 MAPK信號傳導通路，調節哮喘失衡的Th1/Th2細胞因子IL-4和IFN-γ，繼而影響EOS的募集、活化以達到治療哮喘的目的，為穴位埋線治療哮喘提供實驗依據。本研究通過貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準(批號20210012)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠40只，6周齡，體質量(200±50)g，購于湖南長沙天勤生物技術有限公司，實驗動物使用許可證SCXK(湘)2019-0014。飼養于貴州中醫藥大學動物中心實驗室，濕度(55±2)%，室溫(25±2)℃，12 h/12 h明暗周期，提供普通飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑及儀器

卵蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁，上海源葉科技有限公司(貨號S12015、S30353)，HE染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號20200115、20190603)，北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛(貨號3710)，天津市大茂化學試劑廠；地塞米松磷酸鈉注射液(貨號XRF0624)，貴州光正制藥責任有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號1610185)，美國BIO-RAD公司；ECL化學發光試劑盒(貨號WBKLS0100)，美國密理博公司；快速瑞氏-吉姆薩染色試劑盒，貨號E607315，生工生物工程(上海)股份有限公司。

RM2235型切片機、EMUC7型超薄切片機，德國萊卡公司；SA-YLS-8B型小動物霧化給藥儀，江蘇賽昂斯生物科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；1704150型轉膜機，美國BIO-RAD公司；BX51型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HT7700型透射電鏡，日本Hitachi公司。

1.3 分組與造模

40只大鼠適應性喂養1周后，根據計算機隨機數字表法分為正常組、模型組、西藥組和穴位埋線組，各10只。參考文獻方法制備哮喘模型[8]，造模過程分為致敏和激發2個階段。除正常組外其余各組大鼠于實驗第1天腹腔注射1 mL 10% OVA和10%氫氧化鋁混懸液致敏，實驗第8天以上3組大鼠重復上述過程以加強致敏，正常組大鼠在相同時間腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL。第15天起除正常組外其余各組大鼠分別放于小動物霧化給藥儀中，給予1% OVA溶液霧化吸入激發，霧粒直徑3～5 μm，每日1次，每次30 min，持續2周。霧化過程中進行觀察并記錄，以大鼠出現煩躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、鼻癢抓鼻等表現提示造模成功。

1.4 治療方法

參考文獻進行埋線針具的準備，事先準備一次性無菌7號注射針針頭和羊腸線若干，置于無菌彎盤中備用[9]。將羊腸線剪成0.2 cm-0.5 cm左右小段若干，用鑷子將羊腸線從無菌7號注射針針尖穿入，再將預先剪去針尖的毫針(0.30 mm×50 mm)從注射針針尾部穿入，組成1套埋線針具備用。

正常組和模型組每日正常喂養，不予任何處理。西藥組于實驗第15天起腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(1.5 mg/kg)，每日1次，連續2周，具體注射量根據人和動物間體表面積折算的等效劑量比值進行換算[10]。穴位埋線組于實驗第15天進行埋線，由于羊腸線吸收時間長，實驗過程中僅埋線1次，穴位選取“肺俞”“腎俞”“脾俞”“定喘”和“膻中”，具體穴位定位方法參照全國“十三五”規劃教材《實驗針灸學》[11]。“肺俞”“定喘”斜刺6 mm，“脾俞”“腎俞”直刺6 mm,“膻中”針尖向上平刺6 mm，緩慢將腸線推入穴內，覺注射針內有空虛感時方可出針，并檢查有無線頭外露，確保腸線已埋入大鼠體內。

1.5 標本制備

在末次激發后的24 h內用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，切開胸腔充分暴露肺組織和氣管后進行肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織標本的制備。

1.5.1 BALF制備 分離出氣管后結扎右主支氣管，立刻將2 mL 0.9%氯化鈉溶液緩慢注入左肺中，見左肺逐漸變得膨隆后輕柔按壓肺組織，20 s后立即緩慢回抽灌洗液，如此反復抽注3次，后將灌洗液收集于離心管中。分別重復上述操作3次，將灌洗液4 ℃保存，用于EOS相對含量的測定。

1.5.2 肺組織制備 絲線結扎右肺門后取下右肺，4%多聚甲醛緩沖液中固定用于HE染色；取右上肺組織數塊(每塊約100 mg)放于1 mL EP管中-80 ℃保存，用于提取蛋白；取右下肺時在1～3 min內快速取下2 mm×2 mm大小的肺組織，立即放入1 mL的EP管中，電鏡固定液室溫固定2 h后轉移至4 ℃保存，用于透射電鏡觀察。

1.6 指標檢測

1.6.1 引喘潛伏期 計數引喘潛伏期，即從霧化激發開始至大鼠出現呼吸急促、搔鼻抓面等哮喘癥狀的時間，以s為單位觀察記錄10 min，若潛伏期超過10 min則引喘潛伏期以600 s計。

1.6.2 HE染色觀察肺組織病理形態學 肺組織標本經4%多聚甲醛固定48 h后，清水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，組織浸蠟，常規石蠟包埋，連續切片厚度為4 μm。切片進行常規二甲苯、梯度乙醇至水脫蠟處理，蘇木素染色后自來水沖洗，鏡下觀察著色情況，封片后顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.6.3 電鏡觀察肺組織EOS超微結構 將標本從電鏡固定液中取出，磷酸鹽緩沖液沖洗并浸泡過夜，再用1%鋨酸緩沖液固定1 h，梯度酒精脫水，包埋、聚合后用超薄切片機進行切片，透射電鏡觀察EOS的超微結構并拍照保存。

1.6.4 瑞氏染色觀察BALF中EOS相對含量 BALF常溫離心，棄掉上清液后用移液槍將細胞沉渣懸液打勻，滴加在載玻片上制作灌洗液涂片。干燥后放入甲醇固定液中5～10 min，滴加適量的染色液到載玻片上，室溫孵育5～10 min。蒸餾水洗滌風干后封片，光學顯微鏡下觀察并計數EOS的相對含量。EOS的相對含量=EOS的數量/細胞數量×100%。

1.6.5 Western blot檢測肺組織p-p38 MAPK、IFN-γ、IL-4蛋白表達 取100 mg肺組織蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度。按相同蛋白濃度進行上樣，電泳，PVDF轉膜，快速封閉，4 ℃過夜孵育一抗(β-actin 1︰1000，p-p38 MAPK 1︰300，IFN-γ1︰500，IL-4 1︰500)，洗膜后孵育二抗(1︰5000)。滴加化學顯色液后用圖像分析系統對目的條帶進行檢測,Image lab軟件分析處理條帶，以β-actin作為內參進行對比，計算該蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠引喘潛伏期的變化

表1示，與正常組比較，模型組大鼠引喘潛伏期明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠的引喘潛伏期明顯延長(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組引喘潛伏期縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠引喘潛伏期比較

2.2 各組大鼠肺組織病理形態學變化

圖1示，正常組大鼠肺組織形態結構基本正常，支氣管周圍未見明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠支氣管管腔縮小，管壁增厚、變形，支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤；西藥組大鼠支氣管形態結構基本接近正常，周圍無明顯炎性細胞浸潤；穴位埋線組大鼠支氣管變形緩解，周圍炎性細胞浸潤減少。

注：紅色箭頭示大量炎性細胞聚集于支氣管周圍；黑色箭頭示支氣管管壁增厚、變形；黃色箭頭示氣管管腔縮小

2.3 各組大鼠肺組織EOS超微結構的變化

正常組大鼠肺組織中可見EOS包膜完整，細胞內含嗜酸性顆粒且中心鍵明顯，細胞處于靜息狀態；模型組可見EOS胞膜破裂，細胞質不均勻，內含有腫脹、密度不均的嗜酸性顆粒，EOS處于活化狀態；西藥組可見EOS胞質皺縮，細胞內可見含受損細胞器的自噬泡樣結構，細胞處于凋亡狀態；穴位埋線組可見EOS細胞體積縮小，胞內同樣可見空泡樣結構(見圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)透射電鏡圖片(×6000)

2.4 各組大鼠BALF中EOS相對含量變化

表2示，與正常組比較，模型組大鼠EOS的相對含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠EOS的相對含量明顯降低(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組大鼠EOS的相對含量升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠BALF中EOS相對含量比較

2.5 各組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4、IFN-γ蛋白表達變化

表3圖3示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達水平降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4、IFN-γ蛋白表達比較

注：A正常組；B模型組；C西藥組；D穴位埋線組；磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 mitogen-activated protein kinase, p-p38 MAPK)，白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)，γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)

3 討論

哮喘屬于中醫學“哮病”范疇，主要病機為宿痰內伏于肺遇外邪而引動。中醫認為哮喘為本虛標實之證，在肺為實、在腎為虛，強調“急則治其標，緩則治其本”“發時治肺，緩時治腎”等治療原則。同時有研究發現，哮喘的長期發作不僅存在氣道炎癥、氣道痙攣等“肺實”表現，還存在因免疫功能紊亂導致機體出現的防御能力低下等“腎脾皆虛”表現[12，13]。因此，臨床大多數學者提倡以“標本兼治”原則治療哮喘更為合適[14，15]，既要宣肺降氣平喘，緩解哮喘炎癥，又要調理臟腑功能，改善機體免疫。課題組前期研究也證實，從標本兼治的角度選穴論治哮喘，其治療效果優于單純治標或治本[15]。經文獻查閱發現，脾為生痰之源，肺為貯痰之器，調理肺、脾、腎三臟既可扶助正氣又可祛除宿根宿痰，是從根本上治療哮喘的方法；同時“定喘”為治療哮喘的經驗穴，具有定喘止咳、發散風寒的作用。因此本實驗在前期研究的基礎上增加了“脾俞”和“定喘”2個穴位[15]，從“標本兼治”的角度選取“肺俞”“腎俞”“脾俞”“定喘”和“膻中”進行穴位埋線。

Th1/Th2免疫失衡是哮喘重要的發病機制之一，由Th1和Th2細胞分泌產生的相關細胞因子的失衡可對應激反應下的炎癥起到一定調控作用，EOS也會受到這一過程的影響。本實驗結果顯示，模型組大鼠肺組織中p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達升高，IFN-γ蛋白表達下降，BALF中EOS的相對含量升高，EOS處于活化狀態。提示在炎癥反應的刺激下，p38 MAPK的活化可以促進Th2細胞分泌IL-4、抑制Th1細胞分泌IFN-γ，從而促進EOS在炎癥組織中的浸潤和活化。經治療后發現，西藥組和穴位埋線組大鼠肺組織中p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達下降，IFN-γ蛋白表達升高，BALF中EOS相對含量下降，EOS內出現細胞自噬樣的結構改變。提示地塞米松和穴位埋線可以抑制p38 MAPK的激活和Th2細胞分泌IL-4，促進Th1細胞分泌IFN-γ，從而減少EOS在炎癥組織中的浸潤和活化。相關研究表明，p38 MAPK信號通路與哮喘的發病，特別是Th1/Th2失衡免疫學發病機制密切相關，p38 MAPK在被炎癥反應激活的同時，也參與了炎癥細胞因子基因的表達和蛋白合成的調控[16-19]，說明p38 MAPK的激活在Th1和Th2細胞分化中起著重要作用，可以調節IL-4等致炎因子與IFN-γ等抗炎因子的分泌，影響生物體致炎和抗炎反應的平衡，這與本實驗研究結果相符。同時，本實驗通過透射電鏡觀察發現，穴位埋線可對哮喘大鼠肺組織中EOS活化的過程起到一定抑制作用，可引起EOS出現細胞自噬樣細胞凋亡的表現，因此推測這可能也是穴位埋線治療哮喘的作用機制之一。

綜上所述，穴位埋線可以減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀，其機制可能與抑制p38 MAPK的信號傳導，調節IL-4和IFN-γ的表達水平，糾正Th1/Th2的免疫失衡，抑制EOS的浸潤和活化有關。從實驗結果來看，雖然穴位埋線治療哮喘的效果較地塞米松稍差，但激素的長期使用可能引起藥物依賴、代謝紊亂和感染等不良反應，而穴位埋線更為安全、便捷，患者的依從性更好。因此，穴位埋線作為中醫治療哮喘的特色方法之一仍然具有一定的優勢。