基于代謝組學研究清達顆粒減輕高血壓所致心臟損傷的生物學機制?

陳曉萍，程 瑛，劉慧馨，沈阿靈,3，褚劍鋒,3，謝秋容,3，楊燕燕，彭 軍,3△

(1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福州 350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福州 350122；4.福建中醫藥大學實驗動物中心，福州 350122)

高血壓是目前最常見的心血管疾病之一，中國高血壓調查統計數據顯示，我國18歲及以上居民高血壓患病率為27.9%，患病人數高達2.45億，但其知曉率和治療率仍不足一半，控制率僅為16.8%[1]。據世界衛生組織調查統計顯示，高血壓導致45%以上的患者死于心臟疾病，可見，在高血壓的發展進程中，心臟病是導致患者最終死亡的首要原因之一[2]。因此，防治高血壓所致心臟損傷顯得尤為重要。

國醫大師陳可冀院士在長期的臨床實踐中，系統總結了高血壓的發病規律，形成了中西醫結合防治高血壓的學術思想，認為高血壓早期是其防治的重要突破口，并針對早期高血壓以肝陽上亢為主證，伴心火上炎的發病特點，創制了清達顆粒，由天麻(12 g)、鉤藤(10 g)、黃芩(6 g)、蓮子心(5 g)4味中藥組成，具有清肝熱、平肝陽、瀉心火之效，臨床用于治療早期高血壓肝陽上亢、心火上炎證[3]。臨床研究證實，清達顆粒顯著降低肝火亢盛型1級高血壓患者血壓[4]。進一步的基礎研究證實，清達顆粒能夠顯著抑制自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)刺激小鼠血壓的持續上升，改善高血壓引起的血管重構，并有效抑制心肌肥大、腎臟纖維化、腦組織炎癥等靶器官損害[5-10]。然而，其對心臟等靶器官的保護作用和機制仍有待進一步深入。

AngII作為一種重要的心血管活性物質，其異常調控不僅促使高血壓的發生與維持，也參與調控心肌能量代謝，導致心臟收縮功能障礙，加劇心室重構的進展[11,12]。課題組前期研究已經證實，清達顆粒能夠改善SHR心臟組織內代謝產物的異常調控，減輕心臟炎癥，但其對于心肌代謝紊亂的作用機制并不明確[13]。代謝組學通過研究差異表達的內源性代謝產物，觀察生物體新陳代謝和內環境穩態中代謝產物的動態變化規律，進一步揭示生物體的生理病理變化，找出與之相關的生物標志物，有助于闡明發病機制及體內能量代謝途徑[14]。因此，本研究運用高通量液相色譜-串聯質譜技術(Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進行非靶向代謝研究，分析其調控代謝產物及其通路的潛在機理，以期從代謝調控途徑豐富清達顆粒減輕高血壓所致心臟損傷的作用機理，為其臨床抗高血壓應用提供實驗依據。本研究已通過福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理審查編號2019053)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級10周齡雄性C57BL/6小鼠15只，體質量(25±2)，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號SCXK滬2017-0005。福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室飼養。

1.2 藥物及配制

清達顆粒由天江藥業有限公司制備(批號1704306)，根據《藥理實驗方法學》，按體表面積折算系數換算給藥劑量，人與小鼠的折算系數為0.0026，計算出清達顆粒給藥劑量為1.145 g/kg/d，給藥量為100 μ/只灌胃給藥。根據小鼠平均體質量，配制成濃度為286.25 mg/mL的清達顆粒溶液，即稱取286.25 mg的清達顆粒粉末置于無菌離心管內，加入1 mL生理鹽水充分溶解，每日現配現用。

1.3 主要試劑及儀器

AngII(批號Ab12018)，美國Abcam公司；異氟烷(批號970-00026-00)，深圳市瑞沃德公司；伊紅染色液(批號G1100)、蘇木素染色液(批號G114)，北京索萊寶公司；植入式膠囊滲透壓泵(批號2002D)，美國Alzet公司。

小鼠無創血壓測量系統，美國Kent公司；Vevo 2100超高分辨率小動物超聲影像系統，加拿大VisualSonics公司；生物組織石蠟包埋機，湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司；全自動石蠟切片機，德國Leica公司；Illumina Miseq測序儀，美國Illumina公司。

1.4 高血壓模型的構建及給藥

將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組和清達顆粒組各5只。根據Alzet滲透泵說明書配制AngII溶液，并將其灌注至膠囊泵內，對照組則灌注等體積的生理鹽水。隨后將裝填完成后滲透壓泵置于生理鹽水中，放在37 ℃恒溫箱過夜以平衡。采用異氟烷氣體麻醉小鼠，常規消毒后用眼科剪剪開小鼠頸背部，分離表皮及皮下結締組織植入滲透泵，縫合皮膚切口。模型和清達顆粒組給予AngII埋泵(500 ng/kg/min)，并分別給予生理鹽水和清達顆粒溶液(1.145 g/kg/d)灌胃；對照組給予生理鹽水埋泵及等體積生理鹽水灌胃共2周。

1.5 小鼠無創尾動脈血壓檢測儀監測血壓

采用Kent無創血壓儀測量小鼠埋泵14 d后的收縮壓、舒張壓以及平均動脈壓。測量血壓前保證環境安靜，提前打開加熱板使溫度處于35 ℃，隨后將小鼠裝入束縛器中，在距鼠尾根部約1 cm的位置裝上閉塞套，然后套入容積壓力傳感器，在黑暗狀態下穩定10 min后開始測量血壓。閉塞套和傳感器循環充氣與放氣15次，取其平均值。

1.6 小動物超聲檢測小鼠心臟功能

采用動物超聲儀進行無創的心臟功能測定。前一天行左胸前脫毛后，用2%異氟烷吸入麻醉仰臥位固定于37 ℃恒溫加熱板上并用1.5%異氟烷維持麻醉，保持心率400-450次/分。在前胸涂抹耦合劑，采用頻率為30 MHz的探頭取左室長軸切面。用M模式記錄心室內徑和室壁厚度，并計算出左室射血分數(left ventricle ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricle fractional shortening，LVFS)。

1.7 HE染色觀察心臟形態學改變

取小鼠心臟，用4%多聚甲醛中固定24 h后，用石蠟包埋心臟組織，將包埋好的組織用切片機切成4 μm薄片，隨后將薄片放至37 ℃水中展片，用載玻片撈起后置于45 ℃恒溫箱中烘干。隨后進行二甲苯脫蠟處理，蘇木素染色，自來水沖洗，碳酸鋰飽和水溶液返藍1 min后進行伊紅染色，最后將片吹干，用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察心臟組織的病理改變情況。

1.8 代謝組學檢測

取小鼠心臟組織用液氮碾碎，用含水、甲醇、乙腈和丙酮的提取液(1:3:3:3)提取，將樣品在-20 ℃孵育30 min，并在4 ℃離心(14000 rpm，15 min)，除去上清液，放入到新的離心管中進行真空干燥。每個樣品的上清液10 mL使用Q Exactive質譜儀分析。質量控制(quanlitycontral，QC)樣本從每個萃取后樣品中取等量體積混合，14000 rpm離心5 min，將上清液轉入新的上樣瓶內用于HPLC-MS/MS分析，由北京博奧晶典生物技術有限公司完成。

1.9 HPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 Column (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫55 ℃，流速0.35 mL/min。流動相為Buffer A由水、10 mM醋酸銨組成；Buffer B由水、90%乙腈、10 mM醋酸銨組成。按照液相色譜洗脫梯度進行洗脫。質譜條件：正負離子各進行1次掃描，先進行正離子掃描，所有樣品結束后再進行負離子掃描，全掃描范圍m/z 70-1050。全掃描中選擇離子強度TOP10的母離子進行二級質譜鑒定。母離子采用HCD方法進行碎裂，進行二級質譜序列測定，最終生成質譜檢測原始文件。

分析條件：將質譜檢測得到的原始數據導入用Compound Discover軟件進行數據提取處理。處理過程一般包括噪音過濾、保留時間對齊、質譜峰提取、樣品間化合物對應、化合物鑒定、Gap的填補、背景值的扣除。其中化合物鑒定利用mzCloud和綜合數據庫ChemSpider在線搜索完成。采用MetaX軟件對數據進行無監督的主成分分析(principal components analysis，PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)，采用OPLS-DA模型第一主成分的變量重要性值投影(variable important in projection，VIP)值篩選差異代謝物，并通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway進行差異代謝物的代謝通路注釋和富集分析。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 清達顆粒對高血壓模型小鼠血壓和體質量的影響

圖1A-C示，各組小鼠血壓監測結果與對照組比較，模型組小鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，清達顆粒組小鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。各組小鼠體質量比較(圖1D示)，差異無統計學差意義(P>0.05)。可見，清達顆粒可以抑制Ang II誘導的小鼠血壓升高，對小鼠體質量未見明顯影響。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 清達顆粒對高血壓模型小鼠心臟功能的影響

圖2示，小鼠心臟功能結果，與對照組比較，模型組小鼠的LVEF和LVFS明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，清達顆粒組小鼠的LVEF和LVFS明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。可見，清達顆粒可以改善Ang II誘導的高血壓模型小鼠的心臟功能降低。

注：LVEF：左室射血分數；LVFS：左室短軸縮短率。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 清達顆粒對高血壓模型小鼠心臟病理形態的影響

圖3示，HE染色結果，對照組小鼠心肌細胞排列整齊，橫紋結構清晰，細胞質染色均勻，細胞核大小均一。與對照組比較，模型組小鼠心肌細胞排列紊亂無序，橫紋結構不清，橫截面積明顯增大，胞漿染色加深，胞核濃縮深染、部分心肌細胞腫脹變性。與模型組比較，清達顆粒組小鼠心肌組織病理性改變有所改善。可見，清達顆粒可以改善AngII誘導的高血壓模型小鼠心臟病理學改變。

2.4 OPLS-DA分析

圖4示，在正離子和負離子模式下，QC組樣品總離子流色譜(total ionic chromatography，TIC)圖重合疊加，表明LC-MS/MS檢測系統在整個分析過程中穩定性良好。圖5示，監督性OPLS-DA數學建模分析，能有效降低模型復雜性與提升模型分類判別能力，從而直觀地觀察各組樣本間的分類效果和聚集程度。各組間的正、負離子模式下的OPLS-DA得分結果提示，所有樣本的代謝成分積分點均處于置信區間內，各組樣本點在空間分布上呈左右對稱分離趨勢，組內聚類程度良好，組間無交叉和重疊，分離趨勢明顯，分類效果顯著，提示組間存在顯著的代謝輪廓差異。圖6示，置換檢驗結果提示，OPLS-DA模型無過擬合現象，穩健性良好。可見，模型組與對照組心臟中代謝物存在顯著差異，清達顆粒給藥后小鼠的代謝亦發生顯著變化。

圖3 各組小鼠心臟病理形態的比較(×400)

A.負離子模式TIC圖；B.正離子模式TIC圖。

A.模型組與對照組的負離子OPLS-DA得分圖；B.模型組與對照組的正離子OPLS-DA得分圖；C.清達顆粒組與模型組的負離子OPLS-DA得分圖；D.清達顆粒組與模型組的正離子OPLS-DA得分圖

A.模型組與對照組的負離子置換檢驗結果圖；B.模型組與對照組的正離子置換檢驗結果圖；C.清達顆粒組與模型組的負離子置換檢驗結果圖；D.清達顆粒組與模型組的正離子置換檢驗結果圖

2.5 差異代謝物篩選

以VIP>1、差異倍數(fold change，FC)>2.0或FC<0.5且P<0.05為篩選條件獲得各組差異代謝物(differential expressed metabolomic，DEM)，模型組與對照組間差異代謝產物共25個，其中正離子模式下15個，負離子模式下10個，清達顆粒組與模型組間差異代謝物共112個，其中正離子模式下72個，負離子模式下40個。通過差異代謝物火山圖可以看出，距離中心越遠的點越有可能成為潛在的生物學靶點。將模型組與對照組間的差異代謝產物，與清達顆粒組和模型組間的差異代謝產物進行比較，分析差異代謝產物以觀察清達顆粒治療后的變化趨勢。圖7表示，結果提示清達顆粒干預能夠顯著緩解AngII刺激后組氨酸、腺嘌呤、油酸、亞油酸、驚厥毒素、棕櫚酰鞘磷脂、戊烯酸的表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：圓圈大小代表變量重要性值投影(variable important in projection，VIP)值

表1 差異代謝產物信息比較

2.6 代謝通路富集分析

圖8示，將篩選出的各組差異代謝物導入KEGG數據庫進行代謝通路富集分析，結果顯示模型組與對照組間的差異代謝產物共富集23條代謝相關通路，清達顆粒組與模型組間的差異代謝產物共富集16條代謝相關通路。將差異代謝通路進行交集分析，共涉及9條代謝路徑：亞油酸代謝(linoleic acid metabolism)、嘌呤代謝(purine metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、泛酸和輔酶A生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、不飽和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis)、次生代謝產物生物合成(biosynthesis of plant secondary metabolites)、角質、軟木質和蠟質生物合成(cutin, suberine and wax biosynthesis)、玉米素生物合成(zeatin biosynthesis)。

注：A.模型組與對照組KEGG通路富集柱狀圖；B.清達顆粒組與模型組KEGG通路富集柱狀圖；C.模型組與對照組與清達顆粒組與模型組通路交集

3 討論

高血壓是全球心血管疾病的死亡首因，研究報道每年超過940萬人死于高血壓[1]。截至2016年底，我國高血壓患者已達2.45億，患病率為27.90%且呈逐年上升趨勢，而目前我國高血壓患者的控制率僅有16.8%，即使血壓控制良好的患者，仍存在心、腦、腎等靶器官損害，并最終死于這些靶器官損害，嚴重威脅人類的生命和健康，造成了嚴重社會負擔和經濟負擔[15]。因此，防治高血壓所致心腦腎等靶器官損害是防治高血壓的重要環節。清達顆粒是在陳可冀院士治療早期高血壓的臨床經驗方，天麻平肝抑陽、息風止痙為君，鉤藤清熱平肝、息風定驚為臣，黃芩清熱瀉火為佐，蓮子心清心除煩安神為使，共同發揮出清肝熱、平肝陽、瀉心火的作用[3]。臨床與基礎研究證實，清達顆粒降壓效果顯著，且具有心、腦、腎靶器官保護作用，但其調控作用和機制仍有待進一步深入。

在高血壓發生發展的進程中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的激活是其最關鍵的使動因素，該系統中最重要的效應物質為Ang II，AngⅡ與其受體相結合引起相應的生理效應，醛固酮分泌增加，水鈉潴留進而導致高血壓的發生與維持[16]。前期研究證實，清達顆粒能夠緩解自發性高血壓大鼠和AngII刺激模型小鼠血壓升高[5-10]。本研究同樣通過AngII誘導的高血壓模型小鼠，且進一步驗證了清達顆粒良好的降壓效應。慢性升高的動脈血壓會增加靶器官的壓力負荷，血管重塑和內皮功能異常，可直接影響心、腦、腎等器官的灌注；血壓升高還可以引起交感神經和RASS系統過度激活、代謝異常及炎癥反應，這些非血流動力學改變也將進一步加重、加速靶器官損害[17]。因此，在高血壓的防治過程中，控制血壓的持續上升，并保護心、腦、腎等靶器官損害尤為重要[18]。在心臟保護方面，前期研究發現清達顆粒具有減輕心臟炎癥和纖維化的作用。本研究通過心臟超聲和HE染色結果驗證了清達顆粒改善AngII誘導的高血壓模型小鼠的心臟功能降低和病理形態改變，但其深入的調控機制仍有待進一步深入。

心臟能量代謝是心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的研究熱點，糾正心肌能量代謝重構有望成為開辟心臟相關疾病治療的新向導[19]。本研究通過代謝組學方法篩選出差異代謝物和代謝通路。通過多元統計分析，共篩選出AngII刺激可導致心臟損傷的相關差異代謝產物25個，清達顆粒干預可顯著改變其中8個代謝物，分別為組氨酸、腺嘌呤、油酸、亞油酸、驚厥毒素、棕櫚酰鞘磷脂、戊烯酸。對差異代謝產物進行KEGG通路富集分析，提示清達顆粒對高血壓心臟損傷與苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝、泛酸和輔酶A生物合成，不飽和脂肪酸的生物合成，亞油酸代謝通路等多條代謝通路的調控相關。以往研究發現，高血壓及其所致心肌肥厚與苯丙氨酸代謝紊亂密切相關[20,21]。此外，嘌呤代謝異常將導致其終產物尿酸分泌失衡，與高血壓的進展具有協同效應[22,23]。本次研究結果表明，清達顆粒可以顯著改善高血壓心臟受損過程中的氨基酸、嘌呤以及多種其衍生產物的改變，調節多條代謝通路，從而促使心臟代謝趨于正常化。這也可能是清達顆粒發揮心臟保護作用的重要機制和途徑之一。然而相關代謝產物對心臟功能、病理的影響及清達顆粒的干預作用仍有待進一步深入探討。本次研究在前期基礎上進一步從代謝層面豐富清達顆粒治療高血壓心臟損傷的作用機制，有助于為其臨床抗高血壓應用提供更多實驗依據。