長鏈非編碼RNA lnc-CCDC33-1:1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

李鵬平，蘭霞斌，黃煜慶

1.溫州醫科大學附屬蕭山醫院 杭州市蕭山區第一人民醫院 甲狀腺乳腺外科，浙江 杭州 311201；2.中國科學院大學附屬腫瘤醫院 浙江省腫瘤醫院 頭頸外科，浙江 杭州 310005

甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是主要病理類型（占80%以上）[2]。盡管大部分PTC預后良好，但部分高危特征的PTC存在甲狀腺外侵犯、淋巴結轉移、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B）突變，預后較差[3]，給患者及其家庭帶來較大的身心及經濟負擔。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在多種腫瘤中發揮作用，是潛在的腫瘤標志物或治療靶點[4]。有研究報道lncRNA NAMA、BANCR和PTCSC3等對甲狀腺癌的發生發展有重要作用[5-7]。Lnc-CCDC33-1∶1在甲狀腺癌中的作用鮮見報道。本課題組前期通過基因芯片檢測初步發現lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表達升高[8]。本研究擬進一步擴大樣本量，并結合癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas,TCGA）[9]的數據，分析lnc-CCDC33-1∶1與甲狀腺乳頭狀癌臨床因素的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 本地隊列數據：收集2021年11月至2022年3月杭州市蕭山區第一人民醫院的120例PTC組織及30例癌旁正常甲狀腺組織。所有PTC患者均為初診病例，其中男38例，女82例。根據lnc-CCDC33-1∶1相對表達量中位數分為低表達組（60例）和高表達組（60例），其中高表達組年齡為（41.8±12.9）歲，低表達組年齡為（44.0±12.6）歲。所有病例均經2位以上病理科醫師確診，組織標本在實驗前均儲存于液氮中。其中，臨床特征中甲狀腺外侵犯和多灶性由手術結合病理學報告聯合認定，是否遠處轉移由術前各項檢查（包括胸部CT、腹部B超、PET-CT等）判定，TNM分期根據所獲取的臨床和組織病理學情況，對照美國癌癥聯合委員會（AJCC）第八版癌癥分期系統來判定。本研究經杭州市蕭山區第一人民醫院倫理委員會批準[倫審字（科）[2021]43號]，所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 TCGA隊列數據：選取TCGA數據庫（https∶//cancergenome.nih.gov）中的502例PTC患者臨床及測序資料，其中男135 例，女367 例，根據lnc-CCDC33-1∶1相對表達量中位數分為低表達組（254例）和高表達組（248 例）。其中高表達組年齡為（46.2±15.7）歲，低表達組年齡為（48.4±15.9）歲。

1.2 實時定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）應用TRIzol（美國賽默飛世爾公司）提取組織標本中的RNA；使用PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRa公司）試劑盒反轉錄生成cDNA；應用SYBR Premix Ex Taq II（日本TaKaRa公司），于LightCycler 480 中進行擴增。擴增反應條件：95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，2-ΔΔCt法計算lnc-CCDC33-1∶1相對表達量。lnc-CCDC33-1∶1引物為：F 5’-AAGGCTCAGT GTGAGACCAG-3’，R 5’-GGACTAGGGAATGCTGTGACC-3’，GAPDH引物為：F 5’-GGCCAATCCTGAATCACACCT-3’，R 5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。

1.3 統計學處理方法 使用GraphPad Prism 6、SPSS22 及R 4.0 軟件進行統計分析及繪圖。計量資料以±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例和率表示，2組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析lnc-CCDC33-1∶1對PTC的診斷價值。應用單因素Logistic回歸分析lnc-CCDC33-1∶1表達量和相關臨床特征（淋巴結轉移、甲狀腺外侵犯）之間的關系，其中性別和年齡作為協變量，lnc-CCDC33-1∶1作為自變量，相關臨床特征作為因變量。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中的表達 qRTPCR檢測結果顯示，與癌旁正常組織相比，lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中的表達量升高（P＜0.001），見圖1。

圖1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC和癌旁正常甲狀腺組織中的表達水平

2.2 lnc-CCDC33-1∶1對PTC的診斷價值 ROC曲線結果顯示曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.803（95%CI=0.736～0.869，P＜0.001），以相對表達量0.016作為截點值，Youden指數、敏感度和特異度分別為0.558、81.7%和74.2%，見圖2。

圖2 lnc-CCDC33-1∶1診斷PTC的ROC曲線

2.3 本地隊列中lnc-CCDC33-1∶1與PTC臨床病理因素的相關性 根據lnc-CCDC33-1∶1中位表達值，將本地隊列中的PTC患者分為lnc-CCDC33-1∶1高表達組和低表達組，本地隊列顯示lnc-CCDC33-1∶1表達水平與PTC腫瘤大小（P=0.048）、腺外侵犯（P=0.011）、T分期（P=0.007）和淋巴結轉移（P=0.003）相關，見表1。

表1 PTC中lnc-CCDC33-1∶1表達和臨床病理的相關性（本地隊列，每組n=60）

2.4 TCGA中lnc-CCDC33-1∶1與PTC臨床病理因素的相關性 在TCGA數據隊列中，根據其502例PTC樣本的lnc-CCDC33-1∶1中位表達值，將TCGA組PTC患者分為lnc-CCDC33-1∶1高表達組和低表達組，TCGA組數據顯示lnc-CCDC33-1∶1表達水平與PTC甲狀腺外侵犯（P=0.028）、淋巴結轉移（P＜0.001），見表2。

表2 PTC中lnc-CCDC33-1∶1表達和臨床病理的相關性（TCGA）

2.5 Logistic回歸分析lnc-CCDC33-1∶1與PTC淋巴結轉移及甲狀腺外侵犯的相關性 本地隊列的單因素Logistic回歸分析結果顯示，lnc-CCDC33-1∶1高表達組淋巴結轉移風險為lnc-CCDC33-1∶1低表達組的77.42倍（OR=77.42，95%CI=39.74～115.11，P＜0.001），而lnc-CCDC33-1表達高低不影響PTC甲狀腺外侵犯的風險（P=0.143）。

3 討論

PTC通常是一種預后良好、進展緩慢的腫瘤，一般通過手術或聯合放射碘、促甲狀腺激素（tyroidstimulating hormone,TSH）抑制等治療均能達到很好控制。但是某些高危特征，如高齡、腫瘤大小≥3 cm、甲狀腺外侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移和BRAF突變等與其不良預后相關[10]。盡管術前可通過超聲或CT等影像學方式判斷PTC外侵、淋巴結及遠處轉移等，但這些手段的預測價值有一定的局限性[3]。因此，利用新的分子標志物來早期預測或輔助鑒別PTC高危特征，可能對制定PTC的治療方案和治療后的臨床轉歸有重要意義。

分子標志物已被廣泛運用于多種疾病的輔助診斷和預后評估[11]。在甲狀腺癌中，許多分子標志物，如BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ、galectin-3等，已被證實對術前性質不明確的甲狀腺結節具有輔助診斷作用[12]。除mRNA和蛋白質等分子標志物外，還有許多microRNAs，如miR-146b、miR-221、miR-222、和miR-135b被發現與PTC腺外侵犯、進展期分期、BRAF突變等不良臨床病理特征相關[13]。正如美國甲狀腺協會指南所推薦的，當細胞穿刺也不能明確某些甲狀腺結節的診斷時，可應用這些分子標志物協助診斷[3]。最近的研究顯示lncRNA對腫瘤的發生發展起重要作用[14-16]。在PTC中有研究顯示lncRNA發揮著一定作用，例如YOON等[5]發現lncRNA NAMA在BRAF突變的PTC中表達降低，并與腫瘤的生長阻滯相關；JENDRZEJEWSKI等[7]發現SNP rs944289的患者更易發生PTC，其作用發揮與lncRNA PTCSC3相關。PTCSC3則具有抑癌作用，同時PTCSC3是miR-574-5p的競爭性內源性RNA，PTCSC3可能通過調控miR-574-5p的含量來進一步調節其靶基因而發揮作用[17]。因此，lncRNA也有望成為甲狀腺癌的分子標志物。

本研究發現lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中表達升高，并經ROC曲線證實其具有較高的診斷價值。如果將lnc-CCDC33-1∶1與其他分子標志物聯合應用于穿刺細胞學不能明確診斷的甲狀腺結節的良惡性判斷，可能有助于優化甲狀腺結節的診斷與管理。同時本研究分析lnc-CCDC33-1∶1的表達量與PTC患者臨床病理特征的關系，發現lnc-CCDC33-1∶1與PTC腺外侵犯、淋巴結轉移等高危特征相關，為進一步的功能及機制研究建立了基礎。另外，僅有的一項研究指出，lnc-CCDC33似乎和腫瘤特征性分類有關，例如在胰腺癌中，lnc-CCDC33是糖尿病胰腺癌的特征性基因。而lnc-CCDC33-1∶1作為lnc-CCDC33基因下游非編碼區域的lncRNA，可能在甲狀腺乳頭狀癌的進一步臨床亞群分組中具有一定的意義[18]。近年來，非編碼RNA（ncRNA）被揭示能編碼轉錄小肽分子，代替ncRNA本體發揮腫瘤調節作用。例如在結腸癌中，lncRNA HOXB-AS3能夠編碼53個氨基酸的小肽，該小肽能夠通過抑制PKM介導的葡萄糖代謝重編，從而抑制結腸癌細胞生長[19]。這說明，有可能存在lnc-CCDC33-1∶1編碼小肽的可能，并借此調控甲狀腺癌細胞增殖和轉移。

然而，本研究尚存在一些不足。通過矯正年齡、性別、組織類型和BRAF V600E突變等因素后，發現lnc-CCDC33-1∶1的表達量與PTC的淋巴結轉移風險和包膜外侵犯分風險無關。這意味著，在不同的年齡、性別、組織學類型和基因表達背景的亞組PTC人群中，lnc-CCDC33-1∶1對臨床病理特征具有不同的影響。另外，研究發現本地隊列數據和TCGA數據存在差異結果，即lnc-CCDC33-1∶1對腫瘤大小、腫瘤分期的影響存在差異性。上述的差異可能是不同隊列的年齡構成比差異、種族差異、病例研究年限等因素所致。盡管如此，兩組隊列均指出lnc-CCDC33-1∶1高表達提高了甲狀腺癌淋巴結轉移風險和包膜侵犯風險。

綜上所述，lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表達異常升高，并與PTC高危特征相關。lnc-CCDC33-1∶1有望成為潛在的診斷標志物和治療靶點。但是lnc-CCDC33-1∶1在不同人群中可能存在不同的臨床意義，進一步揭示其在PTC中的具體作用需要擴大臨床樣本。與此同時，lnc-CCDC33-1∶1調節甲狀腺侵襲性的分子機制也需要進一步探索。本研究為甲狀腺癌乳頭狀癌的臨床評估提供新的參考指標，同時為癌進展提供新的分子研究靶點。