Cu-ATSM保護內皮細胞糖氧剝奪再灌注損傷的機制

孟偉陽，吳芳芳，金燦，陳大慶

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 急診醫學科，浙江 溫州 325203

糖氧剝奪再灌注損傷（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）是創傷性顱腦損傷進展的重要機制之一。線粒體對于維持細胞生長發育、細胞穩態、維護正常能量代謝、細胞內鈣離子穩定起著重要作用。線粒體損傷后內皮細胞的通透性增加、網絡結構破壞、ATP產生障礙，隨著線粒體膜破裂，凋亡蛋白被釋放到胞質中，激活凋亡信號通路導致細胞死亡[1-3]。因此，有效地保護線粒體功能能夠減少OGD/R損傷后的內皮細胞凋亡。自噬在細胞生長發育、分化增殖、穩態中起到重要作用。自噬能夠清除損傷的細胞器和蛋白質促進內皮細胞存活，且自噬會造成細胞過度的自我消化導致自噬性死亡[4]。研究表明OGD/R損傷后能夠導致自噬水平顯著上升。PENG等[5]發現抑制ATG3基因能夠抑制自噬，減輕OGD/R損傷后腦微血管內皮細胞的損傷，也能減少OGD/R損傷后炎癥反應。LI等[6]發現使用雷帕霉素或碳酸鋰激活自噬后能夠修復OGD/R損傷后腦微血管內皮細胞的屏障。銅-二乙酰-2（N4-甲基氨基硫脲）[copper-diacetyl-2（N4-methylthiosemicarourea），Cu-ATSM]，因其能夠在缺氧的組織中聚集的特點被作為正電子發射斷層顯像劑，應用于檢測各種缺血性疾病，如心肌缺血、腦卒中、腫瘤等[7-9]。有研究表明Cu-ATSM具有改善帕金森動物模型的運動和認知功能，減少黑質細胞的丟失，增加多巴胺代謝等作用[10]，但至今仍鮮見報道其對OGD/R損傷后內皮細胞的保護作用。本研究擬探討Cu-ATSM對內皮細胞OGD/R損傷后線粒體功能的保護作用及其潛在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞處理及分組 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs，h055，上海Sciencell公司）使用高糖完全培養基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）37 ℃，5% CO2培養。待細胞密度長至80%～90%時，使用0.02% EDTA的胰酶消化細胞進行鋪板后分別按照對照組（Control組），糖氧剝奪再灌注模型組（OGD/R組）、給藥組（OGD/R+Cu-ATSM組）進行相應的處理。OGD/R模型是當細胞密度達到70%～80%時將培養基換成HBSS溶液，隨后將細胞放置0.2% O2的培養箱中培養24 h，隨后復糖復氧12 h。OGD/R+Cu-ATSM組提前2 h給予Cu-ATSM 1 μmol/L，Control組細胞完全培養在37 ℃、5% CO2培養箱36 h，間隔30 min觀察細胞形態。

1.2 藥品及試劑 Cu-ATSM（68341-09-3）購于上海默克有限公司，CCK-8（C0037）試劑、JC-1（C2006）購于上海碧云天生物技術有限公司，MitoTracker?Red線粒體紅色熒光探針（40741ES50）購于上海翊圣生物科技有限公司，ATG5（12994T）、Beclin1（3495T）、LC3I/II（12741T）均購于美國CST公司。

1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將HUVECs（5×105個細胞/孔）鋪板于6 孔板中，各組進行相應處理后，使用PBS洗滌，2 000 r/min離心10 min，5 μL V-FITC黑暗中孵育15 min。在流式分析前將5 μL碘化丙啶加入管中。使用BD FACS Calibur流式細胞儀（購于美國BD公司）進行流式細胞術分析，并通過Flowjo軟件進行分析。每個樣品每次含有3個復孔，實驗重復3次。

1.4 線粒體膜電位測定 細胞長滿后，按照5×105個細胞/孔的密度將HUVECs懸液加入到共聚焦培養皿中，進行相應的實驗處理后加入適量的JC-1染色工作液，37 ℃，孵育20 min，然后用JC-1染色緩沖液（×1）洗滌后加入適量細胞培養基，用熒光顯微鏡采集相應的圖像。各組實驗重復3次。

1.5 線粒體形態染色 以5×105個細胞/孔的密度將HUVECs細胞懸液鋪到6孔板中，進行相應的處理后，加入含有MitoTracker?Red工作液的新鮮培養基，37 ℃，避光孵育30 min后，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液常溫固定30 min，PBS清洗，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS清洗，含有DAPI的抗熒光猝滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡采集相應的圖像。各組實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測自噬相關信號通路 提取各組蛋白運用BCA法測定蛋白濃度，配置上樣總量為40 μg的蛋白體系，-20 ℃保存。選取12%的凝膠體系進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍跑至底部時，結束電泳。取出凝膠，PVDF用甲醇活化后，300 mA，90 min進行電轉。隨后進行5%脫脂牛奶中，室溫搖床封閉90 min。4 ℃搖床過夜孵育一抗，隨后孵二抗，最后采用曝光機曝光相應的條帶，使用Image Lab 5.2分析各自的灰度值。各組實驗重復3次。

1.7 細胞熒光檢測 以5×105個細胞/孔的密度將HUVECs懸液鋪到6孔板中，進行相應的處理后，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液常溫固定30 min，PBS清洗，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS清洗，5% BSA封閉，37 ℃，30 min，相應一抗4 ℃過夜，PBST清洗，相應二抗37 ℃避光敷育1 h，PBST清洗，含有DAPI的抗熒光猝滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡采集相應的圖像。各組實驗重復3次。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS21.0統計軟件進行統計學處理。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HUVECs的凋亡情況比較 與Control組比，OGD/R組損傷后HUVECs凋亡細胞數目明顯增多，而OGD/R+Cu-ATSM組HUVECs凋亡細胞數目減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組HUVECs的凋亡情況

2.2 各組線粒體染色及其膜電位的情況比較Control組線粒體形態以細絲狀為主，而OGD/R組損傷后線粒體形態從高度相互連接的細絲狀線粒體變成點狀，而OGD/R+Cu-ATSM組處理后線粒體重新恢復成線狀，比較各組絲狀線粒體數量，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。各組HUVECs進行JC-1染色測定膜電位，Control組的線粒體染色以紅色為主，提示線粒體為聚集體，OGD/R組損傷后JC-1染色主要以單體（綠色）的形態存在，即Control組的聚集體（紅色）轉化為單體（綠色），線粒體膜電位下降，提示線粒體損傷；OGD/R+Cu-ATSM組JC-1染色主要以聚集體（紅色）的形態存在，即OGD/R組單體（綠色）到聚集體（紅色）轉化，提示線粒體損傷好轉，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 Mito-tracker檢測各組處理后線粒體染色情況

圖3 JC-1檢測各組處理后線粒體膜電位情況

2.3 各組自噬相關蛋白的表達情況比較 與Control組比，OGD/R組損傷后HUVECs中的ATG5、Beclin1、LC3II蛋白表達量顯著上升，差異有統計學意義（均P＜0.05）；而OGD/R+Cu-ATSM組治療后這些蛋白的表達量較OGD/R組顯著下降，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖4A-D。與Control組比，OGD/R組LC3II蛋白表達增多，表現為胞漿處綠色熒光增多，而OGD/R+Cu-ATSM組LC3II蛋白表達減少，胞漿處綠色熒光減少，見圖4E。

圖4 Western blot檢測各組處理后ATG5、Beclin1、LC3II的表達情況

3 討論

腦缺血再灌注損傷是創傷性顱腦損傷的重要發病機制之一[11]。腦微血管內皮細胞在缺血再灌注損傷后細胞間的連接蛋白受到破壞，血腦屏障開放造成有害物質進入腦組織導致繼發性損傷[12]。與此同時，有研究表明創傷性顱腦損傷急性期細胞的凋亡數目與患者的神經功能的恢復有關[12]。因此，早期有效抑制內皮細胞凋亡是治療創傷性顱腦損傷重要手段。本研究采用OGD/R模擬腦缺血再灌注損傷，采用HUVECs模擬血腦屏障中的人腦微血管內皮細胞。

線粒體作為胞內重要的細胞器之一，在能量代謝、電子的傳遞、細胞穩態起著至關重要的作用[13]。近年來，線粒體功能的研究是缺血再灌注損傷的熱點之一。腦缺血再灌注損傷后線粒體功能障礙，線粒體膜電位紊亂，能量產生減少，鈣離子超載，活性氧釋放等最終都會導致凋亡信號通路激活從而造成細胞的凋亡[14]。因此，保護線粒體功能是減少缺血再灌注損傷后細胞凋亡的重要途徑之一。

線粒體功能的紊亂會誘發細胞發生自噬清除受損的細胞器，而OGD/R損傷后自噬水平的升高與神經功能的恢復密切相關[14]。自噬又稱為II型程序性細胞死亡，指在饑餓、缺氧、衰老等應激情況下細胞依賴溶酶體降解、選擇性清除再循環利用受損或老化的細胞器。越來越多的研究表明自噬在腦損傷中扮演著重要的角色，適度的自噬在一定程度上促進細胞的存活，維持細胞穩態，而過度的自噬會激活TRAIL導致自噬性細胞死亡[15]。研究表明在腦損傷后，神經元中出現典型的自噬性壞死，主要表現為GFP-LC3II和p62免疫熒光的增多[16]。XIE等[17]發現在新生兒小鼠腦損傷模型中，ATG7 基因敲除后，其神經元的凋亡減少。Cu-ATSM最早作為乏氧顯像劑，近年來的研究也越來越廣泛[8]。YOSHII等[18]研究發現64Cu-ATSM能夠抑制U87MG膠質母細胞瘤腫瘤的生長并延長了生存期。HUNG等[10]研究發現Cu-ATSM能夠減少ONOO-2誘導損傷的α-突觸核蛋白聚集從而改善帕金森模型的認知功能。本研究探討了Cu-ATSM對OGD/R損傷后HUVECs的作用。

研究發現Cu-ATSM能夠通過保護線粒體形態，維持線粒體膜電位，從而減少HUVECs細胞凋亡。Mito-tracker染色結果顯示Cu-ATSM能夠使OGD/R損傷后的點狀線粒體重新恢復成絲帶狀，JC-1染色結果顯示Cu-ATSM能夠使得線粒體從OGD/R損傷后的單體到聚集體轉化，維持線粒體膜電位。流式細胞結果顯示Cu-ATSM能夠大大減少OGD/R損傷后的內皮細胞凋亡。由此可見，Cu-ATSM能夠通過保護線粒體功能從而減少內皮細胞的凋亡。XU等[19]發現NaHS能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制OGD/R損傷后的自噬水平從而保護線粒體功能穩定。JU等[20]發現葫蘆素I能夠通過抑制自噬水平的激活減少OGD/R損傷后的氧化應激水平從而減少神經元凋亡。本研究Western blot結果顯示Cu-ATSM能夠降低OGD/R損傷后自噬相關蛋白如ATG5、Beclin1、LC3II的表達。因此，得出結論Cu-ATSM能夠減少OGD/R損傷內皮細胞的凋亡，并且以上作用極有可能是通過抑制損傷后的自噬水平導致的。當然本研究也有很有不足之處，尚未引用自噬激活劑或自噬抑制劑反向驗證結果自噬是否為其潛在機制，并未深入討論氧化應激、炎癥、PI3K/Akt通路、Nrf2通路等水平的變化，尚未從動物模型中驗證藥物的治療效果等，均有待后續進一步研究。