女貞子精油的提取工藝及其抑菌抗氧化活性

劉艷紅，翟辛敏，李二嬌，張滕，彭汝月，朱明慧，趙胡

(1.阜陽師范大學 信息工程學院，安徽 阜陽 236000；2.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236000)

女貞子，又名女貞實和冬青子，是木犀科植物女貞的果實，分布于我國東部、南部、西南部及中部各地[1]。研究表明，女貞子具有抗癌[2-3]、抗炎[4]、抗骨質疏松[4]、降低血糖和血脂[5]、調節免疫[5]、保肝[3,6]、護腎[6]、抗氧化[7]、延緩衰老[7]等作用。女貞子含有多種化學成分，主要是萜類、揮發油、黃酮類、苯乙醇苷類、多糖等，其中女貞子精油中含有豐富的不飽和脂肪酸[8]。因此，女貞子具有較高的營養價值和藥用價值。

目前，植物精油的提取方法有壓榨法、水蒸氣蒸餾法、溶劑浸提等傳統提取法，還包括超臨界CO2萃取法（SFE-CO2）、分子蒸餾法（MD）、微波輔助提取法（MAE）和超聲波萃取法（UAE）等新型提取技術[9-10]。其中壓榨法工藝簡單，能有效避免熱敏性物質的損失，但所得提取物純度不高，保存時間短[10]。水蒸氣蒸餾法提取成本低，適用于難溶或不溶于水且揮發性好的精油的提取和分離，可是存在高溫破壞精油熱敏性成分的缺點[10]。溶劑浸提法具有操作方便，降低能耗的優點，但是有機溶劑沸點較低，易揮發，有易燃易爆的危險[11]。SFE-CO2法具有環保節能、選擇性高和溶解能力可調的優點，但該法操作成本較高[9,11]。MD 法加熱時間短，提取溫度低，產品質量和產率高，但是對設備技術要求高，生產能力有限[12]。MAE 法可以加快提取速度，縮短提取時間，同時還可以節省溶劑，提高得率，但精油易變性失活[9,12]。UAE 法是利用超聲波的空化效應，破壞植物細胞結構，使溶劑進入細胞，加速提取工藝的進程，降低提取時間[13]，該法具有提取溫度低，耗時短，節能高效，提取率高等優點。近年來，超聲波萃取法在天然產物提取工藝中的應用越來越廣泛，常被應用于植物精油的輔助提取，且多種方法聯合使用能克服單一方法的缺點，也是未來精油業發展的主要趨勢[11]。

在研究的基礎上將超聲波萃取技術與石油醚冷提技術相結合，以期彌補單一提取法的缺點，解決精油提取率低和提取溫度過高的問題。旨在通過探究超聲波輔助石油醚浸提技術提取女貞子精油的最優工藝參數及其所得精油的抑菌效果和抗氧化活性，為女貞子資源的綜合利用和新型食品抗氧化劑和果蔬保鮮劑及抑菌藥物開發提供理論基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

女貞子采摘于阜陽師范大學信息工程學院校內女貞子樹，大腸桿菌(Escherichia coli,或E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,或S.aureus)均為實驗室保存菌種。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試驗儀器

無線觸摸式超聲波細胞粉碎儀（SCIENTZ-950E），寧波新芝生物科技股份有限公司；落地式高速冷凍離心機（H5-25KR），湖南可成儀器設備有限公司；冷凍干燥機，北京博勱行儀器有限公司；分析天平，上海越平科學儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-4J），金壇市杰瑞爾電器有限公司；旋轉蒸發器（RE-52），上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵（SHZ-D（III）），河南省予化儀器有限公司；雙人單面水平敞開式凈化工作臺（SW-CJ-1Cu），蘇州智能凈化設備有限公司；生化培養箱（BPC-250F），上海一恒科學儀器有限公司。

1.2.2 試驗試劑

石油醚（沸點60～90 ℃)，西隴科學股份有限公司；三氯乙酸、過二硫酸鉀（過硫酸鉀）、無水三氯化鐵，國藥集團化學試劑有限公司；LB 肉湯，北京奧博星生物技術有限責任公司；LB 瓊脂，杭州百思生物技術有限公司；抗壞血酸，上海展云化工有限公司；無水乙醇；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），杭州微生物試劑有限公司；鐵氰化鉀，上海埃彼化學試劑有限公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2' 氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽（ABTS），阿拉丁試劑（上海）有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 女貞子精油提取

1.3.1 材料預處理

采摘生長狀況良好的女貞子果實，剔除未成熟及破爛果實。去除柄與葉，用清水沖洗數次，除去灰塵。自然晾干2～3 h 后，進行冷凍干燥48 h。將冷凍干燥后的樣品用粉碎機破碎，過60 目篩，除去果皮和果核后稱重備用。處理好的樣品裝入密封袋中，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 女貞子精油提取工藝流程

圖1 女貞子精油提取工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of essential oil extraction from Ligustrum lucidum

1.3.3 女貞子精油的提取方法

準確稱取女貞子粉10 g 置于150 mL 燒杯中。按料液比1∶5（g/mL）沿杯壁向燒杯內加入石油醚50 mL。在超聲波細胞粉碎儀中于200 W 粉碎10 min。取出放置于通風櫥內靜置沉淀3 h，然后取上清液，在4 ℃下4000 r/min，離心15 min。將離心后的上清液混合到蒸餾燒瓶中，在65 ℃旋轉蒸發儀中蒸發至一定量，轉移至EP 管中。然后于85 ℃水浴鍋上蒸發至石油醚完全揮發。最后稱重，計算女貞子精油提取率，同時收集女貞子精油并存放于4 ℃或-20 ℃冰箱內備用。

1.3.4 女貞子精油提取率的計算

準確稱取女貞子粉10 g，記為m1，經超聲波處理與石油醚浸提后，離心取上清液旋轉蒸發，此時，稱量EP 管重，記為m2，旋轉蒸發結束后收集女貞子精油與石油醚混合物，置于水浴鍋上蒸發至石油醚完全揮發，再次稱重，記為m3。提取率的計算式為

1.4 女貞子精油提取的單因素試驗設計

在查閱文獻[11,13]及預實驗的基礎上，以女貞子精油的提取率為指標，分別選取料液比（g/mL）為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，超聲波功率50、100、200、300、400 W，浸提時間為0.5、1、3、5、7 h 三個因素為變量，進行單因素實驗。

1.5 女貞子精油提取的正交試驗設計

基于單因素試驗結果，運用L9(33) 正交表，以女貞子精油提取率為評價指標，選擇料液比（A）、超聲波功率（B）、浸提時間（C）做三因素3 水平試驗，每組試驗平行操作3 次，取每組平均值作為最終提取率。因素水平設計見表1。

表1 L9(33)正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experimental design of L9(33)

1.6 女貞子精油的抑菌實驗方法

采用濾紙片擴散法[12,14]，選擇金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗菌，女貞子精油經過濾除菌后收集備用，將殺菌過的濾紙片浸泡在女貞子精油中3 s 左右，取出濾紙片放在接種試驗菌的平板上，37 ℃培養，24 h后觀察抑菌圈，并用游標卡尺每隔24 h 測量一次抑菌圈直徑。

1.7 女貞子精油的抗氧化實驗方法

1.7.1 女貞子精油總還原能力的測定

參照郭冬云等[14]的方法稍作修改。以抗壞血酸作為對照，以蒸餾水調零，測定不同質量濃度的處理樣品在700 nm 波長處的吸光度，并平行測定3 次。吸光度越大表示其還原力越強。

1.7.2 ABTS 自由基清除能力的測定

參照文獻[17]方法，并在此基礎上做適當改進。以抗壞血酸作為對照。ABTS 自由基清除率計算式為

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為等體積Vc對照；A0為等體積蒸餾水。

1.7.3 DPPH 自由基清除能力的測定

參照羅亞飛等[15]的方法，以抗壞血酸做為對照，并用無水乙醇調零。

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為等體積Vc對照；A0為等體積蒸餾水。

1.8 數據分析

各實驗平行重復3 次，取平均值，實驗數據由Excel 2019 軟件處理分析。

2 試驗結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對女貞子精油提取率的影響

由圖2 可知，女貞子精油提取率隨料液比的增大呈先升高后下降最后趨于平緩的趨勢，且在料液比（g/mL）為1∶5 時達到最大，為6.18%。分析原因可能是因為當料液比增大時，其傳質推動力也隨之增加，會加大女貞子精油從植物細胞擴散到液相中速度，但當料液比增大到一定程度后，傳質推動力將不再增加，女貞子精油提取率趨于下降[16-18]。因此，料液比（g/mL）為1∶5 時，女貞子精油的提取效果較好。

圖2 料液比對女貞子精油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of essential oil of Ligustrum lucidum

2.1.2 超聲波功率對女貞子精油提取率的影響

由圖3 可知，在超聲波功率50～200 W 范圍內，女貞子精油提取率逐步上升，且幅度較大。在200 W 時，獲得最大提取率為6.83%。在200～400 W 時女貞子精油提取率逐步下降。經過分析，這可能是因為超聲波功率的增加，使得機械剪切作用和空化作用增強，分子擴散速度也隨之提高，促進女貞子精油的提取[19]。但是，當繼續增加超聲波功率時，功率過高會使得空化作用持續增強，縮短女貞子原料在超聲場中的停留時間，降低了水溶劑滲透到女貞子原料組織內部的幾率，從而使得女貞子精油提取量趨于平衡，對應的女貞子精油提取率下降[19]。因此，當超聲波功率200 W時，女貞子精油提取率最高。

圖3 超聲波功率對女貞子精油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of essential oil of Ligustrum lucidum

2.1.3 浸提時間對女貞子精油提取率的影響

由圖4 可知，石油醚浸提的時間在0.5～3 h 內，女貞子精油提取率隨浸提時間增加呈增高趨勢，當浸提時間為3 h 時，提取率最高達6.27%。超過3 h 時后提取率逐漸下降，在5～7 h 提取率趨于平衡。這是因為在提取初期，原料中的女貞子精油含量較高，固液間的濃度差較大，因此擴散驅動力也比較大，使得油脂分子能夠不斷地擴散到溶劑中，從而使提取率不斷增大[20]；但隨著提取時間延長，溶劑中的女貞子精油逐漸趨于飽和，溶液體系的滲透壓也逐漸趨于平衡，女貞子精油提取量不再增加，相對應的提取率反而下降[20]。因此，在浸提時間為3 h 時，女貞子精油的提取效果最好。

圖4 浸提時間對女貞子精油提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of essential oil of Ligustrum lucidum

2.2 女貞子精油提取的正交試驗結果及分析

由表2 正交試驗結果分析可知，正交試驗最佳組合為A2B2C2，同時結合單因素試驗結果，確定女貞子精油提取的最佳工藝參數為料液比1∶5，超聲波功率200 W，溶劑浸提時間3 h。由極差分析可得，各因素對女貞子精油提取率的影響程度由強到弱的順序依次為B＞C＞A，即超聲波功率（W）對女貞子精油提取率的影響最大，其次是溶劑浸提時間，最后是料液比的影響最小。

表2 正交實驗結果與分析Tab.2 Orthogonal experiment results and analysis

2.3 驗證實驗

其他條件不變，在料液比1∶5，超聲波功率200 W，溶劑浸提時間3 h 的條件下提取女貞子精油，得女貞子精油提取率為5.673 %，高于正交試驗組水平，與正交實驗結果吻合。

2.4 女貞子精油抑菌活性試驗結果分析

如表3 所示，女貞子精油對大腸桿菌及金黃色葡糖球菌均具有抑制效果。其中女貞子精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑平均為（7.07±0.81）mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑平均為（6.72±0.54）mm。這與何新蕾[21]利用水酶法提取的女貞子精油對細菌有抑制效果的結論相吻合。

表3 女貞子精油抑菌試驗結果與分析Tab.3 Antibacterial test results and analysis of Ligustrum lucidum essential oil

2.5 女貞子精油的抗氧化活性測定結果與分析

2.5.1 女貞子精油總還原能力的測定結果與分析

還原劑通過還原性作用，可以給出自身電子，達到清除自由基的目的，例如維生素C 還原劑的還原能力越強，其抗氧化能力就越強[22-24]。

如圖5 所示，在實驗質量濃度范圍內，女貞子精油具有一定的還原能力，整體趨勢是隨著提取物質量濃度的增加，其還原能力逐漸上升。整體上看，女貞子精油的還原能力弱于抗壞血酸的還原能力[25]（樣品組與抗壞血酸組均稀釋10 倍）。

圖5 女貞子精油總還原能力測定結果與分析Fig.5 Measurement results and analysis of total reducing capacity of essential oil of Ligustrum lucidum

2.5.2 女貞子精油清除ABTS 自由基能力的測定結果與分析

由圖6 可知，女貞子精油具有一定的清除ABTS自由基的能力，其清除能力與樣品濃度有關[26-28]。當樣品質量濃度為30.64 mg/mL 時，女貞子精油的ABTS 自由基清除率為66.1%。當女貞子精油的質量濃度增加到61.28 mg/mL 時，女貞子精油的ABTS 自由基清除率達到76.8%。但其整體的ABTS 自由基清除率要低于對照組抗壞血酸的整體水平。

圖6 ABTS 自由基清除率的測定結果與分析Fig.6 Measurement results and analysis of ABTS free radical scavenging rate

2.5.3 女貞子精油清除DPPH 自由基能力的測定結果與分析

由圖7 可知，女貞子精油對DPPH 自由基的清除率與精油質量濃度呈現明顯的量效關系[29-31]。當精油質量濃度增大時，女貞子精油對DPPH 自由基的清除效果也隨之增加。以抗壞血酸做為參考可知，女貞子精油在一定濃度范圍內對DPPH 自由基的清除能力較高。當女貞子精油質量濃度高于15.32 mg/mL 后，其對DPPH 自由基的清除率趨于平緩，且當女貞子精油質量濃度為61.28 mg/mL 時，其對DPPH 自由基的清除率為97.8%，超過抗壞血酸對DPPH 自由基的清除率的平均水平94%。

圖7 DPPH 自由基清除率的測定結果與分析Fig.7 Measurement results and analysis of DPPH radical scavenging rate

3 結論

超聲波輔助有機溶劑浸提女貞子精油的最佳工藝參數為料液比1∶5，超聲波功率200 W，溶劑浸提時間3 h。在此條件下，女貞子精油的提取率為5.673 %。且影響女貞子精油提取率的因素主次順序依次為：超聲波功率＞浸提時間＞料液比。

女貞子精油粗提物對大腸桿菌和金黃色葡糖球菌均有一定的抑制效果，且具有較高的還原能力。當女貞子精油粗提物質量濃度為61.28 mg/mL 時，其對ABTS 自由基和DPPH 自由基的清除率分別達到76.80%和97.80%。