功能性食品中氨基酸檢測方法研究進展

◎ 陳 晨，陳 妍，陳 婷，倪煒華，王麗麗，施文婷

（嘉興市食品藥品與產品質量檢驗檢測院，浙江 嘉興 314001）

隨著現代食品工業的快速發展，人們的收入水平不斷提高，對食品的認知也得到了提升，現代人們更注重食品的營養價值，更強調科學的飲食結構，具有特殊營養價值和保健功能的食品逐漸成為食品消費的主流。功能性食品作為集營養、保健、增強體質、改善機體功能于一身的新型食品[1-2]，比起普通食品，能夠實現功能化、精準化的營養補充。人們可結合自身實際，通過合理飲食和科學補充營養，實現維持機體健康、有效預防和控制疾病發生的目的[3-4]。因此，功能性食品在當前有著非常廣泛的市場和群體受用基礎。

功能性食品根據不同特定人群的需要而添加相應的功能性因子，如功能性糖類[5]、維生素[6]、皂苷[7]、氨基酸[8]等，因其功效豐富，備受產品生產企業與消費者的青睞。目前功能性因子的種類呈現多元性，針對功能性食品中功能性因子的檢測方法逐漸增多，建立快速有效的檢測方法，構建功能性食品中通用的品質評價準則和規范，對促進功能性食品的發展及“健康中國”國家戰略的實施具有極其重要的意義。其中，氨基酸是構成人體營養所需蛋白質的基本物質，而蛋白質又是人體的生命基礎[9]。作為功能性食品中常用的功能性因子，以其為主要功能性成分的功能性食品種類繁多，然而各類產品的品質參差不齊，因此對氨基酸類功能性食品進行檢測顯得尤為必要。

1 氨基酸檢測技術

1.1 氨基酸分析儀法

氨基酸分析儀先將蛋白質及肽水解成單個氨基酸，然后再進行氨基酸分析，是基于陽離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜儀。氨基酸分析儀是進行氨基酸分離、衍生和檢測的全自動化專用分析儀器，能夠在普通實驗室中配備，操作方便，分離度和重現性較好，且能夠進行批量檢驗，但一般價格昂貴。

姜荷等[10]采用氨基酸分析儀，建立了同時測定功能性飲料中游離牛磺酸和賴氨酸的定量測定方法。牛磺酸和賴氨酸的最低檢出限均為2 nmol·mL-1，線性范圍均為6 ～100 nmol·mL-1，相關系數均大于0.999 7，RSD 均小于5%，回收率在98.7%～100.2%。此方法靈敏度高、操作簡單、重復性好、切實可行。于方園等[11]采用氨基酸分析法對牛乳和大豆蛋白中的多種氨基酸進行分析檢測，不同濃度梯度加標回收率均在94.2%～103.1%，RSD 在0.89%～3.31%。該方法利用氨基酸分析儀，通過模擬摻假實驗對牛乳和大豆蛋白中的17 種氨基酸進行測定比較，發現牛乳中的大豆分離蛋白摻假量可通過天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸6 種特定氨基酸的總含量進行計算，方法簡便，靈敏度高，為牛乳中大豆分離蛋白的摻假鑒別提供了一種新的檢測方法。鐘秋瓚[12]利用氨基酸分析儀測定乳飲料及乳制品中游離甘氨酸含量，研究了樣品前處理方法和儀器色譜分離條件對乳飲料及乳制品中甘氨酸測定的影響。該方法具有較好的重現性，加標回收率為96.4%～100.6%，方法精密度為0.99%，標準曲線線性相關系數為0.999 9。馮志強等[13]用氨基酸分析儀測定含乳飲料中游離甘氨酸含量，研究了樣品預處理方法和儀器色譜分離條件。測得含乳飲料中游離甘氨酸的含量，從而對含乳飲料中是否添加甘氨酸進行分析，此方法具有較好的重現性，添加標準的回收率為98.8%～101.7%，方法精密度為0.53%。SHIM 等[14]利用氨基酸分析儀同時測定嬰幼兒配方奶粉中16 種氨基酸。氨基酸的回收率在87.18%～118.08%，LOD ＜0.059 mg/100 g，LOQ ＜0.198 mg/100 g。

1.2 分光光度法

分光光度法主要利用氨基酸與茚三酮產生藍紫色化合物，測定在某一波長處最大吸收峰值的大小，從而得到氨基酸的含量。此方法檢測成本低且操作方便，適用范圍廣泛，但只能測定一種或一類氨基酸的總含量，不能進行氨基酸的分離[15]。

周菊峰等[16]用差示分光光度法測定決明子中的8 種必需氨基酸，氨基酸與茚三酮生成藍紫色化合物，在8 種必需氨基酸最大吸收波長處分別測定吸光度。該法簡便、準確，結果可靠，適用于內含決明子的功能性食品中各類氨基酸的測定。楊葵華等[17]采用單因素試驗對提取條件進行探究，氨基酸與茚三酮顯色后，用分光光度法測定人參果中氨基酸含量。結果表明，氨基酸含量在2 ～12 mg·mL-1線性關系良好，平均回收率為99.5%，RSD 為2.9%。胡京枝等[18]對含乳飲料中游離氨基酸含量的試驗條件進行了研究，建立了紫外分光光度法測定游離氨基酸含量的測定方法，該方法同樣具有良好的回收率和重復性。

1.3 近紅外光譜法

近紅外光譜法主要利用有機化合物的含氫基團在特定波長范圍內躍遷，產生光譜變化，結合統計方法間接實現氨基酸的定量檢測，具有簡單、快速、無損、環保無污染以及同時測定等優點。

陶琳麗等[19]研究了20 種氨基酸的分子結構與其近紅外光譜的相關性，為在功能性食品中氨基酸的檢測奠定了一定的理論基礎。研究表明，20 種氨基酸在1 000 ～2 502 nm 區域主要存在4 個特征光譜區，有非常明顯的近紅外光譜吸收且差異顯著。因此，可以利用此4 個近紅外光譜特征區域對氨基酸進行定量和定性分析，提高氨基酸近紅外光譜模型預測的準確性。趙琛等[20]提出了用近紅外漫反射光譜技術快速檢測發酵冬蟲夏草[21]中氨基酸含量的新方法。在一定光譜區域范圍內建立了近紅外光譜數據與氨基酸、精氨酸和總氨酸含量間的定量關聯模型，為以冬蟲夏草加工成的功能性食品中氨基酸含量的測定提供一條新的途徑。龔加順等[22]以140 個茶飲料樣品為試材，探討了近紅外線光譜技術（Near Infrared Spectrum Instrument，NIRS）快速測定共飲料品質相關成分的可行性。試驗結果表明，所建立的品質成分近紅外校正模型可應用于茶飲料的總氨基酸（Total Amino Acids，TAA）的快速檢測分析，而無需任何化學藥品。

1.4 電化學分析法

電化學分析法一般是采用不同種類的氨基酸選擇性電極對其進行各種氨基酸的測定。因具有檢測時間短、檢測種類多、無放射無污染等優勢，近年來得到了迅速發展[23]。

王力等[24]根據L-賴氨酸（L-lysine）具有增強三聯吡啶釕[Ru(bpy)32+]電化學發光信號的特性，建立一種毛細管電泳-電化學發光分離檢測L-賴氨酸的新方法。該方法已成功用于飲料中L-賴氨酸的檢測，結果令人滿意，對于部分功能性飲料同樣適用。李笑笑[25]利用毛細管電泳與電化學聯用體系檢測含乳飲料中游離甘氨酸，以自制的石墨圓盤電極為工作電極，得到最低檢測限（S/N=3）為7.9 10-7mol·L-1，乳飲料中游離甘氨酸的加標回收率為83%～109%，為檢測功能性飲料中的氨基酸提供新的方法。

1.5 色譜法

色譜檢測主要利用某一特定的色譜系統（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統）進行混合物中各組分的分離分析，廣泛用于分析多組分樣品。色譜檢測種類較多，按流動相分有液相色譜、氣相色譜、超臨界流體色譜等，按固定相分有填充柱色譜、毛細管柱色譜、微填充柱色譜等。色譜法具有分析速度快、分離效率高、選擇性好等優點。

陳貫昊[26]建立了梯度淋洗-離子色譜-積分脈沖安培檢測法同時測定運動飲料中20 種氨基酸和6 種糖的分析方法。通過對梯度淋洗條件、色譜柱溫度、pH 值以及前處理條件等實驗影響因素的考察，優化出適合同時檢測26 種組分的分析方法。檢出限為0.001 ～0.060 mg·L-1，加標回收率達到86.2%～105.0%（n=5），該方法高效、簡便、靈敏、準確，可用于運動飲料中多種氨基酸和糖的同時測定分析。馮盛斌等[27]建立反相高效液相色譜法檢測維生素功能飲料中L-賴氨酸的含量的分析方法。牛磺酸在線性范圍內相關系數r＞0.999，回收率大于97.6。結果表明，該方法操作性強、靈敏度高，適用于維生素功能飲料中L-賴氨酸的檢測。胡建鴻等[28]建立反相高效液相色譜法（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）同時測定氨基酸保健飲品中16 種氨基酸的分析方法。在各氨基酸的線性范圍內，16 種氨基酸的線性相關系數r在0.999 6 ～0.999 9，平均回收率為96.0%～104.0%。結果表明，本方法專屬性強，操作方便，靈敏度高，可用于氨基飲料中氨基酸的含量檢測。賀習文等[29]建立了離子交換色譜-柱后衍生法測定綠茶飲料中39 種游離氨基酸的分析方法。經過磺酸型陽離子交換色譜柱分離，茚三酮柱后衍生，調節流動相比例和柱溫，39 種游離氨基酸均得到了較好的分離。該方法前處理簡單易操作、實用性強，適用于綠茶飲料中39 種游離氨基酸的檢測。

1.6 質譜法

質譜作為高選擇性和高靈敏度的檢測工具，在氨基酸分析中發揮著重要作用。質譜技術檢測氨基酸主要是根據其質荷比信號推導出分子質量來實現的，蛋白質經完全水解后產生單個的氨基酸殘基，通過質譜分析可以獲得其質荷比信息，通常結合需要結合色譜技術進行鑒定，如LC-MS 以及LC-MS/MS 等。

董亞蕾等[30]建立一種用于檢測富硒食品中4 種硒代氨基酸的超高效液相色譜-串聯質譜法方法。結果口服液中，4 種硒代氨基酸的線性關系良好（r＞0.996），平均回收率為89.0%～104.5%，相對標準偏差均小于7%。該方法對簡單基質的樣品中硒代氨基酸的測定結果準確可靠，但基質效應較為明顯。陶彌鋒[31]建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜分析運動飲料中甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）等16 種氨基酸的方法。16 種氨基酸在0.10 ～10.00 μmol·L-1線性良好，檢出限為0.005 ～0.050 μmol·L-1，定量限為0.03 ～0.20 μmol·L-1，加標回收率為85.1%～96.2%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.9%～4.8%。該方法具有前處理簡單、靈敏度高和檢測速度快的優點，適用于運動飲料中較寬濃度范圍內多種氨基酸的同步分析，為其營養價值測定提供參考。尤佳麗等[32]建立了一種SPE-UPLC-MA/MS測定運動型乳飲料中多種氨基酸的方法，樣品通過固相萃取小柱凈化去除雜質，由超高效液相色譜-四極桿串聯質譜法測定，該方法不同加標梯度回收率在85.1%～96.2%，RSD 在1.1%～5.2%，干擾雜質少，提高了檢測的準確性和精確性。陳彩云等[33]建立了微波水解-液相色譜串聯質譜法（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）測定保健食品中16 種氨基酸的含量，該方法分析速度快、靈敏度高、準確和重復性好，縮短了樣品的前處理時間，可適用于保健食品及功能性食品中16 種氨基酸的快速檢測。

2 氨基酸檢測方法的展望

越來越多以氨基酸為功能性因子的功能性食品涌現，使氨基酸的研究分析方法顯得更加重要。如何研究開發一種快速有效、能同時測定功能性食品中多種氨基酸的檢測方法，對于今后功能性食品品質評價及分析評判具有重要意義。氨基酸的分析研究已成為生命、食品、醫藥等研究領域以及常規的檢驗檢測工作中的重要技術。現階段色譜法已成為氨基酸檢測最為廣泛使用的方法，研究方向主要集中在提高穩定性和靈敏度上。而各種檢測器的更新換代以及各種分析設備的聯用無疑為氨基酸的分析檢測提供了更加有力的保障，高分辨質譜、多級串聯質譜等技術將會使氨基酸分析的靈敏度、準確度、分析速度及自動化程度均提高到一個新的水平。氨基酸檢測方法各有優缺點，今后隨著檢測技術的發展，其應用范圍也會越來越廣。可以預見的是色譜技術與各種技術的聯用將成為檢測的主流，氨基酸的分析速度、靈敏度和重復性將會在未來走上一個新的臺階。由于功能性食品的復雜特性，研發選擇性好、準確度高、前處理簡便的氨基酸檢測方法將是未來的發展趨勢。需要注意的是，功能性食品種類繁多，如何選擇合適的方法檢測其中的氨基酸，還需根據實驗條件、樣品性質種類、檢測靈敏度需求、分析時間長短以及干擾因素等具體判斷。