理化因素對川澤瀉凝集素血細胞凝集活性的影響

郭 艷，陳松梅，張鐘文，劉環燚，劉 超

(樂山師范學院應用生物技術創新研究中心,四川樂山 614004)

川澤瀉(Alismaplantago-aquaticaLinn.)屬澤瀉科澤瀉屬水生地道中藥，在福建、浙江、廣西和四川有廣泛分布，種植規模巨大，2018年產量約20 000 t，僅四川年產量最大，約11 000 t，廣西次之[1]。川澤瀉的藥用處理常采用炮制方法，利用率低，經濟效益差，導致近年來種植戶積極性不高。四川澤瀉和廣西、福建澤瀉品質有差異，有“川澤瀉”“廣澤瀉”和“建澤瀉”之稱[2-3]。劉紅昌等[4]和金立陽等[5]分別對四川澤瀉進行了指紋圖譜研究，為川澤瀉和其他產區澤瀉品質鑒定提供了依據。澤瀉富含澤瀉醇等有機物，具有利尿、抗結石、降血脂、降血糖和保肝等藥效，張慧娟等[6]通過澤瀉中有機化合物成分的分析，對澤瀉的生理應用進行了詳細總結。除小分子有機化合物外，澤瀉藥用塊莖中富含蛋白質，劉超等[7]從四川種植基地川澤瀉塊莖中分離出一種能使人紅細胞凝集的N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物專一性結合含糖凝集素蛋白，分子質量為22.45 kD，等電點pI為6.0。同時利用熒光淬滅技術[7]對川澤瀉凝集素生色基團的分布進行了初步研究，并用化學修飾的方法[8]對川澤瀉凝集素的凝集活性中心氨基酸組成和生物學構象進行了研究。不同來源的凝集素結構穩定和生理功能行駛要求不同的環境因素，特別是凝集素所處微環境的物理與化學因素對凝集素結構和生理功能有明顯的影響，但物理和化學因素對川澤瀉凝集素凝集血細胞活性的影響鮮見報道。該研究探討了溫度、pH、金屬離子等不同物理和化學因素對該生物學活性的影響，為揭示凝集素生物學構象及凝集活性與理化環境的關系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑試驗用川澤瀉采自四川彭山謝家鎮和樂山五通橋冠英鎮。人血液采自樂山師范學院校醫院。兔、雞、魚等動物血液采自樂山市中區海棠路農貿市場。所用化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1川澤瀉凝集素樣品的制備。參照文獻[7]方法并稍作改動，川澤瀉干燥塊莖經研磨、硫酸銨沉淀、離子交換層析(DEAE-Sepharose)和甲殼素N-乙酰葡萄糖胺親和層析得到凝集素樣品，4 ℃保存備用。

1.2.2血細胞懸液的制備。分別取人血(4種血型)和動物(家兔、家雞、鯉魚)血樣10 mL，加少許枸櫞酸鈉，用0.9%生理鹽水1∶1(v/v)混勻離心(2 500 r/min，4 ℃，15 min),重復至少3次洗去血漿其他成分，血細胞沉淀用0.9%生理鹽水稀釋至2%，滴1～2滴0.2%疊氮化鈉，4 ℃保存備用。

1.2.3凝集素凝集血細胞活力的測定。參照文獻[9]在96孔“V”型板上倍比稀釋法檢查凝集血細胞活性。

1.2.4溫度對川澤瀉凝集素凝集血細胞活性的影響。按10 ℃梯度在20～100 ℃，凝集素樣品恒溫10 min后用自來水流水或冰水冷卻至室溫，用A型血細胞懸液測定凝集血細胞活性[10]。

1.2.5pH對川澤瀉凝集素凝集血細胞活性的影響。凝集素樣品對pH為2.0、2.5、3.4、4.0、4.6、5.4、6.0、6.8、7.6、8.4、9.0的系列緩沖液充分透析2 h后用A型血細胞懸液檢查凝集血細胞活性[9]。

1.2.6金屬離子對凝集素凝集血細胞活性的影響。將凝集素樣品溶液在0.05 mol/L的EDTA溶液中充分透析并放置過夜，以除去凝集素樣品中金屬離子，檢測其對血細胞的凝集活性；然后均分為7份，其中一份置于0.9%生理鹽水再次透析除去EDTA后，檢測血細胞凝集活性；再次將其余6份分別滴加一滴0.01 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+，以未經EDTA處理的凝集素樣品為對照，檢測凝集A型血細胞活性[8]。

2 結果與分析

2.1 血細胞凝集活性川澤瀉凝集素對不同種類代表動物血細胞的凝集活性見表1。表1顯示，川澤瀉凝集素對不同類型血細胞的凝集活性存在差異，與劉超等[7]的研究結果一致。在供試血細胞中，川澤瀉凝集素僅對人類血細胞具有敏感性，能夠使人類血細胞凝集，其中對A型血細胞具有一定偏愛性，使A型血細胞凝集的效價為0.95 μg/mL，O型、AB型和B型血細胞凝集效價分別為15.30、15.30和31.50 μg/mL。而對哺乳類家兔以及家雞血細胞無凝集能力，魚類鯉魚血細胞在與川澤瀉凝集素接觸時發生溶血性細胞破裂。凝集素能夠使血細胞凝集是高度專一和復雜的與糖或衍生物識別過程，川澤瀉凝集素能夠識別人類血細胞而不識別哺乳動物家兔、家雞和魚類鯉魚血細胞，是因為川澤瀉凝集素是N-乙酰葡萄糖胺專一性結合凝集素[7-8]，表明川澤瀉凝集素可識別一些乙酰化的糖鏈。由于人類血細胞表面具有N-乙酰葡萄糖胺糖和N-乙酰半乳糖基團[11]組成的糖被。凝集素和人類ABO血細胞表面的N-乙酰葡萄糖胺相互作用，通過凝集素分子橋的作用使血細胞凝集成團。凝集素表現出對A型血細胞的偏愛性，可能是A型血細胞與其他類型血細胞表面糖鏈的空間構象有差異[10]。

表1 凝集素對不同動物血細胞凝集活性Table 1 Hemagglutinating activities of lectin samples to different animal erythrocytes

2.2 溫度對川澤瀉凝集素凝集活性的影響從圖1可以看出，隨著溫度的上升，在20～40 ℃，川澤瀉凝集素對A型血細胞保持較強凝集活性；當溫度上升至40 ℃以后，血細胞凝集活性劇烈降低；當溫度升至80～100 ℃時，凝集素完全失活。表明川澤瀉凝集素和桑巴鐮刀菌[12-13]等凝集素一樣具有40～50 ℃的低耐熱性，不如已知的楊樹菇凝集素、黃精凝集素和石蒜凝集素[14-16]具有70 ℃的高熱穩定性。當凝集素樣品隨溫度高于80 ℃時出現大量的血細胞絮凝沉淀，此時凝集素蛋白質變性，失去凝集血細胞活性，將血細胞包裹成團。

圖1 溫度對凝集素活性的影響Fig.1 Effects of different temperatures on the hemagglutinating activities of APL

2.3 酸堿度對川澤瀉凝集素凝集活性的影響從表2可以看出，當pH在4.0～8.4時，川澤瀉凝集素均呈現對A型血細胞凝集活性，其中在pH為6.0～6.8時，凝集活性最強，這一結果表明凝集素對pH的耐受能力較強，即酸堿度對川澤瀉凝集素凝集活性中心構象影響是漸變過程。當pH為低于5.4或高于7.6時，凝集活性逐漸降低；當pH≤3.4或pH≥9.0時，川澤瀉凝集素不能使血細胞凝集，反而發生過酸或過堿的溶血性細胞破裂。在凝集素等電點pI與pH一致且pH為6.0時凝集活性最強，這一現象與蛋白質等電點溶解度最低原理理論上此時凝集能力應該降低[17]相矛盾，推測可能是由于凝集素溶于等電點溶液中，在測試過程中滴加了幾乎等體積生理鹽水配制的血細胞懸液使測試環境pH高于凝集素的等電點，也有可能是在非等電點環境中引起了蛋白質自身非特異性凝集[16]。

表2 酸堿度對川澤瀉凝集素凝集活性的影響Table 2 The hemagglutinating activities of lectin samples treated with various pH

2.4 金屬離子對川澤瀉凝集素凝集活性的影響從表3可以看出，在用0.05 mol/L EDTA充分透析處理后，川澤瀉凝集素凝集A型血細胞活性消失，表明川澤瀉凝集素蛋白分子中含有維持凝集活性所必需的金屬離子，推測川澤瀉凝集素凝集血細胞生物學活性依賴于金屬離子。經EDTA透析除去金屬離子后的川澤瀉凝集素樣品中分別加入Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+后，凝集血細胞活性均有一定恢復，再次證明川澤瀉凝集素血細胞凝集活性對Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+有不同程度的依賴性。其中對Ca2+的依賴性最強，說明該凝集素與其他凝集素相似[18]對金屬離子有一定選擇依賴性。加入Zn2+后，凝集素的凝集活性沒恢復，表明川澤瀉凝集素血細胞凝集活性對Zn2+無依賴性。在所有測試金屬離子對凝集活性過程中，發現在高濃度(1 000 μg/mL)凝集素條件下，測試血細胞均出現溶血現象，可能是由于高濃度凝集素和金屬離子相互作用，從而引起血細胞微環境滲透壓的變化，造成血細胞破裂。

表3 金屬離子對川澤瀉凝集素凝集活性的影響Table 3 Effect of metal ions on hemagglutinating activity of APL

3 討論

凝集素是一類非免疫來源的能與糖或衍生物可逆專一性結合的蛋白質，在植物、動物、微生物體內廣泛分布。由于凝集素具有細胞識別、信號傳導、細胞免疫、誘導細胞凋亡、誘導分裂、抗腫瘤以及代謝調節等生理功能[19-24]，近年來引起廣泛關注。由于腫瘤細胞中存在異常的糖基化，因此凝集素類糖蛋白常作為腫瘤生物標記物，可以利用凝集素的糖結合專一性特點，開發凝集素作為腫瘤診斷試劑[25]以及腫瘤藥物定向靶位[26]等。現在已經從不同的生物體內分離出近千種凝集素。在應用中環境溫度、酸堿度、氣壓、磁場、金屬離子、蛋白酶以及鹽酸胍、脲、SDS等變性劑對凝集素的生物學活性均有不同程度的影響，實際應用受到一些限制。在已知的植物凝集素研究發現，楊樹菇凝集素[14]、黃精凝集素[15]和石蒜凝集素[16]等普遍對70 ℃具有較強的耐受性，該研究的川澤瀉凝集素與長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]類似呈現弱的熱穩定性，在溫度達到40 ℃凝集活性開始降低，70 ℃時活性也僅40%左右。凝集素的熱穩定性是由凝集素的糖結合位點的空間結構決定的，如果凝集素活性位點僅由蛋白質構成，熱穩定性會較低，如果凝集素活性位點含有糖鏈，熱穩定會增加，由此推測川澤瀉凝集素的血細胞凝集活性位點無糖鏈或者含糖量較低[27]。pH梯度對川澤瀉凝集素凝集活性研究結果表明，在pH 5.4～7.6具有凝集血細胞活性，超過這個范圍凝集活性劇烈下降，在pH 6.0～6.8凝集活性最強，說明川澤瀉凝集素與長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]、面包樹果實凝集素[28]等凝集素一樣具有較強的酸堿耐受性。有許多凝集素血細胞凝集活性依賴于金屬離子，如長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]和條斑紫菜凝集素[29]凝集活性依賴于Ca2+和Mg2+，該研究的川澤瀉凝集素同樣表現出Ca2+的依賴性。據此可以推斷川澤瀉凝集素血細胞凝集活性位點和C型凝集素結構上均具有Ca2+依賴型的糖識別結構域[30]。對于川澤瀉凝集素的研究還將從N-乙酰葡萄糖胺專一性識別分子機理以及理化因素引起凝血活性變化的分子機構基礎進一步研究，特別是血細胞與凝集素分子間相互作用機制和基因分子水平的研究為川澤瀉應用開發提供新的理論基礎。

4 結論

川澤瀉凝集素(APL)是一種N-乙酰葡萄糖胺專一性結合蛋白質，能夠使人類細胞發生凝集作用，并且對A型血細胞還具有一定偏好性。該凝集素在50 ℃以下穩定，當溫度高于60 ℃構象發生變化，凝集活性開始降低，到80 ℃完全失去凝集活性。該凝集素最適pH為6.0～6.8，并且凝集活性依賴于金屬離子，呈現對Ca2+、Mg2+依賴選擇性。