患腹瀉癥狀食蟹猴寄生蟲和致病菌鑒定與診斷

謝永平，賀會利，龐彬輝

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001)

食蟹猴與人類的遺傳同源性高達95%，同時具有繁殖周期短、體型小、性格溫順等優(yōu)點，常用于遺傳學、生理學、免疫學等方面的研究[1]，是國內外重要的實驗動物研究模型[2]。從目前監(jiān)測結果來看，寄生蟲和細菌引起的食蟹猴疾病問題尤為突出[3-5]。寄生蟲檢測發(fā)現，結腸小袋纖毛蟲的感染率高達24.29%，結腸小袋纖毛蟲(Balantidiumcoli)屬于纖毛蟲門動基裂綱毛口目小袋蟲科小袋蟲屬，發(fā)育過程中有滋養(yǎng)體和包囊2種形態(tài)[6]。結腸小袋纖毛蟲是寄生在動物腸道的原生動物寄生蟲，會導致動物機體腹瀉、結腸充血、出血、潰瘍和穿孔等。結腸小袋纖毛蟲病是一種水源性、呈世界性分布的人畜共患原蟲病。大腸桿菌(Escherichiacoli)是臨床上主要引起動物腹瀉的常見細菌。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，周生鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌是動物體內一種重要的腸道菌群，大多不致病，屬于條件性致病菌。其中，某些血清型菌株的致病性強，會引起腹瀉，統(tǒng)稱致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，其血清型復雜，可引起動物腹瀉、肺炎、泌尿道感染和敗血癥等[7]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種革蘭氏陰性條件性致病菌，是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類菌(俗稱肺炎桿菌)，肺炎克雷伯氏菌所致疾病占克雷伯氏菌屬感染的95%以上。肺炎克雷伯氏菌在自然界廣泛存在，容易產生耐藥性，大多存在于人體上呼吸道和腸道，當機體抵抗力降低時，經呼吸道進入肺部，從而引起大葉或小葉融合性實變，以上葉較為多見，此外也可導致腦膜炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染甚至敗血癥等[8]。筆者對20只腹瀉食蟹猴進行臨床檢查、寄生蟲學、分子生物學和細菌學檢查，旨在為食蟹猴腹瀉時的臨床用藥提供科學依據，為預防和治療食蟹猴腹瀉提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病料樣品采集。2021年采集廣西某食蟹猴飼養(yǎng)場患有腹瀉癥狀的成年食蟹猴新鮮糞便樣品20份，裝于干凈的自封塑料袋中，送至實驗室檢測。陽性樣品由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存。

1.1.2試驗動物。食蟹猴1.5～2.5歲，體重2 kg左右，伴有下痢，排出黃色水樣糞便；有時糞便混有血液、惡臭，食蟹猴精神及食欲明顯減退，2 d后其他食蟹猴也相繼出現下痢癥狀。4～5周齡雄性昆明小鼠12只，體重18～20 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.3主要器材與試劑。恒溫培養(yǎng)箱購自上海浦東榮豐科學儀器有限公司；小型臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司；帶測微尺的顯微鏡購自尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；離心管、燒杯、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、60～100目銅篩，均購自南寧生化藥品儀器有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒、2× ESTaqMasterMix、DL 2000 DNA Marker，均購自北京康為世紀生物科技有限公司。BIOWEST凝膠瓊脂購自GENE公司；PCR儀購自天根生化科技(北京)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。伊紅美蘭培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司；血瓊脂平板培養(yǎng)基購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1寄生蟲檢測。采用直接涂片法，首先在載玻片上滴加1滴滅菌的生理鹽水，然后用竹簽挑取少許被檢猴新鮮糞便在生理鹽水中涂抹均勻，最后加蓋玻片后置于光學顯微鏡下觀察。此方法可檢查糞便中大多數蟲卵。

1.2.2PCR檢測。按照試劑盒說明書提取糞便樣品中的DNA，將提取的DNA置于-20 ℃下保存。以提取DNA為模板，參考文獻[9]的方法進行PCR擴增，PCR擴增產物在1.5% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析電泳結果。

1.2.3細菌學檢查。

1.2.3.1細菌分離培養(yǎng)與16S rRNA測序鑒定。無菌條件下采集糞便樣品，分別劃線接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察。挑取4個特征典型的單個菌落純化后進行革蘭氏染色、鏡檢，對細菌進行形態(tài)學觀察。將純化的菌株通過PCR擴增16S rRNA 序列后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.3.2藥敏試驗。采用NCCLS[9]推薦的K-B紙片法，在無菌條件下取100 μL純化后培養(yǎng)的菌液均勻涂于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，選取青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等18種常用抗菌藥物貼在血瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑(Ф)，判定其耐藥性。

1.2.3.3小鼠致病性試驗。選取健康昆明小鼠12只，隨機分成試驗組和對照組2組，每組6只。將分離菌混合培養(yǎng)后按0.2 mL/只(濃度為109CFU/mL)接種于試驗組小鼠腹腔內，對照組注射等量的生理鹽水，觀察并記錄小鼠的臨床癥狀及發(fā)病、致死情況。

2 結果與分析

2.1 寄生蟲檢測經鏡檢發(fā)現，10份糞便中有大量巨大橢圓形或梨形的結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體(圖1)，呈無色透明或略帶綠色淡灰，大小為(30～150)μm×(25～120)μm，蟲體前端略尖，腹面有一胞口，后端略鈍，有一胞肛，體表有斜縱排列的纖毛，可迅速旋轉前進。結腸小袋纖毛蟲包囊呈近圓形，直徑為40～60 μm，呈淡黃或淡綠色，外被2層囊膜，囊壁較厚(圖2)。鏡檢未發(fā)現阿米巴原蟲、鞭蟲、類圓線蟲等寄生蟲。

圖1 結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體(400×)Fig.1 The trophozoite of B.coli(400×)

圖2 結腸小袋纖毛蟲包囊(400 ×)Fig.2 The cystica of B.coli(400×)

2.2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。20份腹瀉食蟹猴糞便中有10份陽性樣品。

2.3 形態(tài)學特征鑒定和16S rRNA測序細菌培養(yǎng)結果發(fā)現，20份糞便在伊紅美蘭培養(yǎng)基上發(fā)現紫黑色帶金屬光澤的細菌，初步判斷為大腸桿菌。經16S rRNA 測序后進行序列比對，伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落與NCBI網站登錄的大腸桿菌(登錄號MN208144.1)同源性為99.79%，證實為大腸桿菌(圖4)。12份糞便樣品在血瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出4個典型菌落，菌落經純化后進行革蘭氏染色、鏡檢，其中1個菌落呈灰白色、中間隆起、膿狀，邊緣呈鋸齒狀，周圍無溶血，經革蘭氏染色后鏡檢可見革蘭氏陰性、細小的點狀菌。經16S rRNA測序后進行序列比對，與NCBI網站登錄的肺炎克雷伯氏菌(登錄號CP052372.1)同源性為99.81%，證實為肺炎克雷伯氏菌(圖5)。另外1個菌落為革蘭氏陰性桿狀菌，經測序與伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落為同一菌落(大腸桿菌)。其余2個菌落經16S rRNA測序后鑒定為環(huán)境菌。

圖4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖5 肺炎克雷伯氏菌Fig.5 Klebsiella pneumoniae

2.4 藥敏試驗結果將分離的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合后進行藥敏試驗，結果發(fā)現分離的大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢噻呋鈉高度敏感，對壯觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、恩諾沙星、氧氟沙星中度敏感，而對青霉素、鏈霉素、慶大霉素等耐藥(表1)。

表1 藥敏試驗結果Table 1 The drug sensitivity test results of the isolated bacteria

2.5 小鼠致病性試驗試驗組小鼠在接種混合菌8 h后精神狀態(tài)變差、活動量減少，24 h后陸續(xù)死亡，最終3只小鼠死亡，表明該菌有較強的致病性。通過解剖死亡小鼠發(fā)現小鼠肺部、肝部出現腫大，有出血點，胃黏膜出血，腸黏膜充血、變薄。通過對腸道內容物的鑒定確定為大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染。對照組小鼠精神狀態(tài)良好，無死亡，剖檢未見明顯病理變化。

注：M.DNA Marker DL 2000；1.陽性對照；2～12.部分病料樣品；13.陰性對照。Note：M.DNA Marker DL 2000；1.Positive control；2-12.Partial samples of epidemic materials；13.Negative control.圖3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠檢測結果Fig.3 The agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

3 討論

腹瀉是臨床上常見癥狀之一，主要是由于飼養(yǎng)不當，細菌、病毒、寄生蟲感染所致。筆者通過對20份腹瀉食蟹猴糞便進行實驗室檢測發(fā)現，10份糞便樣本中檢測到結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體，20份糞便樣本中檢測到大腸桿菌，12份糞便樣本中檢測出肺炎克雷伯氏菌。總體來看，10份糞便樣本為三重感染，2份糞便樣本為大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染，其余8份糞便樣本為大腸桿菌感染。結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體較大且具有運動性，通過寄生蟲鏡檢很容易發(fā)現，同時經PCR方法檢測確定為結腸小袋纖毛蟲。結腸小袋纖毛蟲感染機體后可借助纖毛侵害多種臟器，主要侵害結腸、盲腸、直腸等，造成腸道黏膜的破壞和脫落[10]。通過替硝唑、伊維菌素、甲硝唑治療發(fā)現甲硝唑的治療效果較好，這與前期試驗結果[3]相一致。在治療過程中應避免反復發(fā)作，應多次使用驅蟲藥，以達到徹底控制和消滅該寄生蟲的目的。由于該寄生蟲可導致人感染，在治療和預防猴群發(fā)生結腸小袋纖毛蟲時，應注意飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)工作者以及相關工作人員的個人衛(wèi)生，做好消毒工作，定期對猴場工作人員進行體檢，防止寄生蟲感染。

臨床上常見的引起動物腹瀉的細菌有大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等[11]。大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌均屬于腸道桿菌，其生物學特性有許多相似之處，不容易區(qū)分，給診斷帶來了一定困難[12]。該試驗使用2種培養(yǎng)基，最后進行16S rRNA 基因測序，發(fā)現2種致病菌。藥敏試驗結果表明，這2 種細菌對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢噻呋鈉高度敏感，而對青霉素、鏈霉素、慶大霉素等9種藥物耐藥。為了避免耐藥性的產生，應當科學合理選擇藥物，交替使用不同的抗生素或者聯(lián)合用藥。通過小鼠致病性試驗發(fā)現，這2種細菌均可以引起小鼠感染并死亡，說明混合感染會加重病情甚至造成死亡率上升。致病性大腸桿菌引起的動物腹瀉在臨床上十分常見，是引起人類和動物疾病的重要病原菌，豬、雞、牛、羊等動物均容易感染，不同動物感染后臨床癥狀也不相同[13-17]。機體感染致病性大腸桿菌后，輕者腹瀉，重者出現各臟器炎癥、敗血癥等，嚴重時可致死。在該病的防治方面，要加強飼養(yǎng)管理，及時發(fā)現，徹底治療，減少傳播風險，對場地、用具、車輛等徹底消毒，從根本上杜絕該病的大范圍流行。近年來，肺炎克雷伯氏菌已經成為僅次于大腸桿菌的第二大條件性致病菌，是一種人畜共患傳染病[18]，廣泛存在于呼吸道和消化道，可引起肺炎、腦膜炎、泌尿感染、敗血癥等，畜禽、野生動物、水生動物等均容易感染[19-21]。不合理用藥也會導致該毒株的耐藥性不斷增強，對人類的健康造成很大的威脅。此次調查是首次在腹瀉食蟹猴中分離到肺炎克雷伯氏菌，通過對此次病例分析，可為該病臨床診斷提供參考依據。

目前全世界科研工作者對試驗結果的準確性要求越來越高，對試驗食蟹猴的品質要求也越來越嚴格。廣西因其優(yōu)越的地理位置及適宜的環(huán)境，成為全國人工養(yǎng)殖量最大的食蟹猴養(yǎng)殖基地，因此加強食蟹猴疾病的實時監(jiān)測對于提升其品質具有十分重要的意義。此次調查中檢測到的結腸小袋纖毛蟲、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌均可導致人畜共患病，會對公共衛(wèi)生造成威脅，一旦發(fā)現患此病應立刻采取有效措施，選擇安全、高效的抗寄生蟲藥物和抗生素治療，減少疫病傳播，避免造成不必要的經濟損失。