中老年食蟹猴尿液參考指標(biāo)測(cè)定與比較

邱名寅，呂海洲，周和麗,勞林芳，陳 珠，田朝陽(yáng)

(1.海南金港生物技術(shù)股份有限公司,海南海口 571100；2.海南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院/海南省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570228；3.海南大學(xué)全健康研究院，海南海口 570228)

由于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(non-human primates，NHPs)具有與人類極其相似的遺傳、生理和行為特征[1]，與其他動(dòng)物如嚙齒類、犬和豬相比，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在解剖學(xué)、生理學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)等方面的結(jié)果更可靠，因而在聯(lián)系基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面發(fā)揮重要作用，已成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中理想的模式動(dòng)物。其中，同為舊大陸猴和獼猴屬動(dòng)物的食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)是生物醫(yī)學(xué)研究中使用最為廣泛的2種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[2]，尤以食蟹猴占主導(dǎo)地位。近年來(lái)，我國(guó)的實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有了飛速發(fā)展，已成為全球?qū)嶒?yàn)猴的最大生產(chǎn)供應(yīng)國(guó)。據(jù)中國(guó)實(shí)驗(yàn)靈長(zhǎng)類養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)協(xié)會(huì)(CLPA)2021年統(tǒng)計(jì)，全國(guó)實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖企業(yè)60余家，實(shí)驗(yàn)猴總存欄量23萬(wàn)余只。

由于受新冠(COVID-19)疫情全球大流行、新冠防控疫苗及藥物臨床前動(dòng)物試驗(yàn)研究需求增加、中國(guó)腦計(jì)劃等重大基礎(chǔ)研究項(xiàng)目的啟動(dòng)和禁止從國(guó)外進(jìn)口食蟹猴種源等多重因素的影響，我國(guó)目前存欄的食蟹猴已逐步邁入中老年階段(年齡≥10歲為中年猴；年齡>15歲為老年猴)[3]，普遍出現(xiàn)了種群繁殖率和出生率偏低、供需矛盾緊張和銷售價(jià)格不斷攀升的“一猴難求”的共性問(wèn)題[4]，給整個(gè)醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展帶來(lái)了深遠(yuǎn)影響，已引起業(yè)界和管理部門的高度重視。但這些中老年食蟹猴也為人類衰老相關(guān)的慢性疾病研究所急需的自發(fā)性食蟹猴動(dòng)物疾病模型(如糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病腎病等)的篩查與分析提供了豐富的寶貴資源庫(kù)，實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖企業(yè)迎來(lái)了快速發(fā)展和轉(zhuǎn)型升級(jí)的絕佳機(jī)遇期。

因此，建立中老年食蟹猴常規(guī)的尿液指標(biāo)背景數(shù)據(jù)，不僅對(duì)其篩查與分析應(yīng)用提供重要的參考價(jià)值，也為標(biāo)準(zhǔn)化的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)管理和日常疾病的檢測(cè)與診斷發(fā)揮日益重要的作用。筆者對(duì)100只10～20歲的食蟹猴的體重和尿肌酐、24 h尿液量、尿微量白蛋白、24 h尿微量白蛋白和尿液微量白蛋白與肌酐比值等尿液指標(biāo)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的測(cè)定，并進(jìn)行了性別間的比較，為中老年食蟹猴資源在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料普通級(jí)食蟹猴100只，雄性21只，雌性79只。年齡10～20歲；動(dòng)物生產(chǎn)單位為海南金港生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(瓊)2020-0001]。動(dòng)物均飼養(yǎng)于海南金港生物技術(shù)股份有限公司普通級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(瓊)2019-0017]，飼養(yǎng)條件為12 h/12 h晝夜周期，相對(duì)濕度40%～70%，溫度20～26 ℃，不銹鋼代謝單籠飼養(yǎng)，飼喂全價(jià)膨化飼料，動(dòng)物飲水瓶自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)海南金港生物技術(shù)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1體重(body weight，BW)。動(dòng)物空腹時(shí)間>16 h，08:00—10:00稱重，稱重前肌注鹽酸氯胺酮(0.1 mL/kg)進(jìn)行麻醉，采用電子?jì)雰撼舆M(jìn)行稱量并逐一記錄。

1.2.2尿液指標(biāo)(urine index)。將100只待檢動(dòng)物分批放入不銹鋼代謝單籠內(nèi)飼養(yǎng)用于收集24 h尿液，尿液收集方法為在代謝單籠底部固定紗布用于尿液過(guò)濾和糞尿分離，玻璃燒杯放置在代謝籠底部用于收集尿液，并用加裝有冰袋的泡沫盒對(duì)玻璃燒杯進(jìn)行冷藏保溫。24 h尿液收集完畢后測(cè)定24 h 尿液量(24-hour urine volume,24 h-UV)，然后取出部分尿液離心(離心力3 000 r/min，4 ℃離心10 min),取尿液上清，應(yīng)用日本東芝120全自動(dòng)生化儀及上海科華檢測(cè)試劑盒進(jìn)行尿肌酐(Urine creatinine，UC)指標(biāo)檢測(cè)和美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特IMMAGE特定蛋白分析儀及配套試劑進(jìn)行尿微量白蛋白(Urine microalbumin，UM)指標(biāo)檢測(cè)，并用24 h-UV和UM相乘后換算得出24 h尿微量白蛋白(24-hour urine microalbumin，24 h-mAlb)，用UM和UC相除后換算得出尿液微量白蛋白與肌酐比值(microalbumin-creatinine ratio，ACR)。

1.3 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，比較各測(cè)定指標(biāo)雌雄間差異，顯著性差異水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重指標(biāo)雌、雄性動(dòng)物的體重指標(biāo)(BW)差異極顯著(P<0.01)，雄性顯著高于雌性(表1)。

2.2 尿液指標(biāo)雌性動(dòng)物的尿肌酐(UC)與雄性動(dòng)物相比差異顯著(P<0.05)，雌性動(dòng)物24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白與肌酐比值(ACR)與雄性動(dòng)物相比差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 中老年食蟹猴體重和尿液指標(biāo)Table 1 The body weight and urine index of 100 middle and old-aged cynomolgus monkeys (mean±SD)

3 結(jié)論與討論

在生物醫(yī)學(xué)研究中，動(dòng)物參考值在評(píng)價(jià)臨床前發(fā)現(xiàn)和選擇健康受試動(dòng)物方面起著至關(guān)重要的作用[5]。包括食蟹猴在內(nèi)的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床生理生化指標(biāo)是重要的試驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常血常規(guī)參考值、血液生化參考值是病理學(xué)、毒理學(xué)以及新藥安全性評(píng)價(jià)研究等選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要依據(jù)之一[6-7]。尿液指標(biāo)也是重要的試驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于發(fā)現(xiàn)很多已經(jīng)出現(xiàn)或者仍隱匿的機(jī)體健康問(wèn)題，具有重要的臨床意義與價(jià)值。但有關(guān)中老年食蟹猴(>10歲)的尿液指標(biāo)的參考值鮮見(jiàn)報(bào)道。

該研究測(cè)得的中老年食蟹猴(10～20歲)體重指標(biāo)(BW)表現(xiàn)出極顯著性別差異。結(jié)合李冰[8]和Choi等[5]的研究結(jié)果，隨著年齡的增長(zhǎng)食蟹猴雌雄間體重差異會(huì)越來(lái)越顯著。這就提示在做試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)時(shí)注意不同年齡段雌雄動(dòng)物間體重指標(biāo)的差異問(wèn)題。

尿液指標(biāo)檢測(cè)分析對(duì)于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的自發(fā)型疾病模型篩選至關(guān)重要，但限于動(dòng)物的習(xí)性，采集非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物隨機(jī)尿(Spot urine)樣本顯得較為困難，通常的做法是采用代謝籠進(jìn)行一段時(shí)間的尿液收集，將動(dòng)物排泄的尿液和糞便分離，但收集過(guò)程易受到糞便、飲水等因素的影響而波動(dòng)較大。所以考慮收集24 h尿液量并做定量分析來(lái)減少上述因素的干擾，以期最大限度地發(fā)揮尿液指標(biāo)在相關(guān)研究中的參考價(jià)值。

該研究測(cè)得的中老年食蟹猴的24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白量(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白與肌酐比值(ACR)雌雄間均無(wú)顯著差異，尿肌酐(UC)指標(biāo)雄性顯著高于雌性。研究表明，通常在機(jī)體健康的情況下，僅有少量白蛋白可通過(guò)尿液排出體外，尿液檢驗(yàn)通常可見(jiàn)少量尿微量白蛋白。一旦腎功能發(fā)生損傷，腎小球基底膜通透性增高，經(jīng)尿液排出體外的白蛋白量將顯著提升，致使尿微量白蛋白指標(biāo)升高[9]。

微量白蛋白可作為糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)發(fā)生的早期指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于糖尿病腎病的早期診斷和判斷病情的發(fā)展。朱華等[10]研究表明，尿微量白蛋白在糖尿病腎病的診斷與分期中沿用已久，但不同計(jì)算方法的結(jié)果正常值范圍有明顯差異，尤以1 L結(jié)果報(bào)告時(shí)，由于受尿量影響較大，正常范圍較寬，易使部分異常標(biāo)本落入正常范圍而延誤診斷。為此，該試驗(yàn)在研究過(guò)程中，通過(guò)收集24 h尿液量和測(cè)定尿微量白蛋白，進(jìn)而測(cè)算出24 h尿微量白蛋白量。Gross等[11]根據(jù)尿白蛋白的排出量分為微量白蛋白尿(Microalbuminuria，MAU)和大量白蛋白尿(Macroalbuminuria，CAU)。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)推薦的MAU的診斷參考標(biāo)準(zhǔn)：300 mg>24 h-mAlb≥30 mg 或300 mg/g >ACR≥ 30 mg/g，CAU或明顯腎病診斷參考標(biāo)準(zhǔn)：24 h-mAlb≥300 mg 或ACR≥300 mg/g[12]。該研究也在100只食蟹猴中發(fā)現(xiàn)了3只(2公和 1母)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物，是否為糖尿病腎病動(dòng)物模型還需做進(jìn)一步的病理分析。因此，該研究為非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物自發(fā)型代謝性疾病模型的篩選分析提供了初步的尿液指標(biāo)參考值。

此外，日趨嚴(yán)重的人口老齡化問(wèn)題急需開(kāi)展生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，以便更好地了解生物衰老以及特定年齡相關(guān)疾病和狀況的生物學(xué)機(jī)制和治療策略[1]。自然衰老的中老年食蟹猴也會(huì)發(fā)生類似于人類的與年齡相關(guān)的疾病，且表現(xiàn)出相似的個(gè)體間變異性[13]，在疾病特征和發(fā)生發(fā)展機(jī)制方面能較全面反映人類衰老情況[14]，因此是研究衰老機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)化所必不可少的動(dòng)物模型[15]。該研究為中老年食蟹猴動(dòng)物疾病模型的挖掘和開(kāi)發(fā)利用提供了較為基礎(chǔ)的尿液指標(biāo)背景資料。