木犀草素通過TLR4/NF-κB途徑對哮喘模型幼鼠炎癥的影響

劉克新，龔本新，何飛雪，黎勝年，鄭 英，雷華鳳

1.中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）東院區(qū)兒科，廣東 深圳 518000；2.中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）婦幼保健部，廣東 深圳 518000

哮喘是一種常見的氣道炎癥性疾病，以反復阻塞氣道為特征，與黏液分泌過多和氣道炎癥細胞浸潤有關。目前，全球哮喘患者超過3億多人，且數(shù)量逐年上升［1］。目前治療哮喘的方法主要是使用吸入皮質類固醇、長效β2抑制劑等藥物。但目前關于哮喘的治療過程中，部分治療的療效不確定，且因藥物的副作用，患者依從性比較差［2］。因此有必要探究新的藥物控制哮喘的癥狀。

Toll 樣受體（Toll-like receptors 4，TLR4）是一種模式識別受體，研究報道OVA激活Toll樣受體通路及其下游靶點核因子κB 蛋白（Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB），引起Th2相關哮喘炎癥反應的加重和炎癥細胞因子基因表達，NF-κB是一種多細胞轉錄因子，在調節(jié)炎癥和免疫反應中也起著重要作用［3］。抑制NF-κB 可以減輕卵清蛋白（OVA）誘導的過敏性哮喘［4］。

木犀草素（Luteolin，LT）以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高，具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。據最新研究，呼吸道癥狀咳嗽、咳痰、喘息，均與氣道慢性炎癥有關，如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、變應性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被認為與局部的炎癥浸潤有關。炎癥的存在使得氣道的免疫應答混亂，患者常出現(xiàn)氣道反應性增高，治療的手段首先應該消除氣道的慢性炎癥浸潤。目前常用糖皮質激素消除氣道炎癥，但糖皮質激素的副作用較多，不宜長期應用。研究表明，LT抑制巨噬細胞磷酸化，抑制轉錄因子NF-kB的活性，能夠抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞產生細胞因子IL-6，TNF-α。后兩種細胞因子在炎癥機制中扮演非常重要的角色，是反映炎癥程度的敏感指標。LT 還能提高IFN-γ，降低特異性IgE，減少嗜酸性粒細胞的浸潤。另外，LT 除了抗炎、抗過敏作用以外，還具有抑制PDE、抗SARS、HIV 病毒特性，其原因為抑制SARS 病毒前S 蛋白的活性，從而阻止其進入宿主細胞。LT用于治療COPD、支氣管哮喘、慢性咽炎以及變應性鼻炎等引起的慢性咳嗽。LT是一種具有抗炎作用的天然黃酮類化合物，具有抗炎和自由基清除作用［5］，目前研究發(fā)現(xiàn)LT 能減輕過敏性小鼠支氣管收縮和氣道高反應性調節(jié)，但對LT通過TLR4相關途徑的哮喘尚無研究。因此，本研究探討木犀草素是否可以通過抑制TLR4/NF-κB 途徑誘導抑制哮喘模型的炎癥。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇SPF 級SD 雌性幼年小鼠40 只，4 周齡，體重（100±20）g。廣東省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)深圳大學SPF動物房。

1.2 主要試劑和儀器

木犀草素（中國MCE公司）， 卵清蛋白（哈爾濱百杰斯生物公司），大鼠血清IL-2、IL-4 ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所），RevertAid First Strand Cdna［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，PowerUp SYBRTM Green Master MIX［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，兔抗大鼠TLR4 抗體（美國abcam 公司），兔抗大鼠NF-κB p65 抗體（美國abcam 公司），兔抗大鼠GAPDH 抗體（美國abcam公司），HRP-羊抗兔IgG抗體（美國abcam公司），超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 哮喘造模

將幼年小鼠適應性飼養(yǎng)3 d 之后，除去正常組幼鼠10只，剩余30只幼鼠在第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白和氫氧化鋁預混制備的乳化液共1 mL（100 mg 氫氧化鋁和1 mg卵清蛋白）。第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d分別給予霧化吸入含3% OVA的生理鹽水20 min，正常組以及生理鹽水代替卵清蛋白進行腹腔注射及霧化吸入。

2.2 藥物干預

OVA干預造模小鼠組隨機分為3組，分別是哮喘模型組、LT低濃度組、LT高濃度組，每組10只小鼠。LT低濃度組、LT高濃度組均從第1次哮喘激發(fā)開始（造模第15 d），每只每天分別予1 mg/kg，2 mg/kg 腹腔注射，以上各組連續(xù)給藥14 d后，然后把小鼠處死進行實驗研究。

2.3 實驗標本采集

第30 d，進行幼鼠眼眶取血，靜置15 min 后，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取上層血清，保存于-80 ℃冰箱中；開胸取出左上肺組織，冷凍于液氮中；取出右上肺組織，放入4%多聚甲醛固定。

2.4 小鼠氣道高反應檢測

采用小鼠無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠氣道高反應情況，按照肺功能儀檢測步驟，使用不同劑量（0 μg /mL、6.25 μg /mL、12.50 μg /mL、25.00 μg /mL、50.00 μg /mL、100.00 μg /mL）乙酰甲膽堿激發(fā)后，檢測各組小鼠氣道高反應。

2.5 血清IL-2、IL-4含量測定

取凍存的血清，采用ELISA 方法檢測各組大鼠血清IL-2、IL-4的濃度，具體實驗方法根據ELISA試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，計算IL-2、L-4濃度。

2.6 肺組織病理切片炎癥觀察

將右上肺從4%多聚甲醛中取出，進行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅染色，封片，顯微鏡下觀察肺組織炎癥情況。

2.7 肺組織TLR4、NF-κb pP65的RNA表達

從NCBI庫查找大鼠TLR4、NF-κB 基因，根據基因設計TLR4、NF-κB，取每組左上肺組織，放入液氮中充分研磨，按照RNA 提取試劑盒說明書，提取RNA。測量RNA濃度，根據RevertAid First Strand cDNA試劑盒，轉錄成CDNA；根據PowerUp SYBRTM Green Master MIX 試劑盒操作步驟，上機檢測TLR4、NF-κB的RNA表達。

2.8 肺組織TLR4、NF-κB pP65的蛋白表達

取出肺組織，放入液氮中充分研磨，加入生理鹽水100 μL及1 μL蛋白酶抑制劑，14 000 r/min，離心后，取上清液，測蛋白濃度，根據蛋白濃度加入1×loading buffer，100 ℃水中煮10 min，取30 μL 每孔上樣，進行SDS-PAGE 電泳，轉膜后，3%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠TLR4 抗體（美國abcam 公司），兔抗小鼠NF-κB pP65 抗體，兔抗大鼠GAPDH 抗體等一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌5 次，加入HRP-羊抗兔IgG 抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌5 次，加ECL 發(fā)光液，置于儀器中發(fā)光顯色，imagJ計算灰度值，

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 小鼠氣道高反應檢測

通過大鼠氣道高反應檢測，模型組在乙酰甲膽堿濃度為50.00 μg /mL、100.00 μg /mL時，氣道高反應明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；LT 低濃度、LT高濃度組在乙酰甲膽堿濃度為50.00 μg/mL、100.00μg/mL時，氣道高反應低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 小鼠氣道高反應檢測 μg/mL

3.2 各組大鼠血清IL-4、IL-2含量

ELISA檢測血清IL-4、IL-2濃度，模型組血清IL-4濃度明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組血清IL-2 濃度明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；LT低濃度組、LT高濃度組血清IL-4濃度低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LT低濃度組、LT高濃度組血清IL-2 濃度高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-2含量（±s） pg/mL

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-2含量（±s） pg/mL

a 表示與模型組比較，P＜0.01；b 表示與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組（n=10）模型組（n=10）LT低濃度組（n=10）LT高濃度組（n=10）IL-4 54±2.5 127±4.5a 80±3.4b 67±2.1b IL-2 154±6.3 56±5.6b 134±3.4b 123±3.5b

3.3 各組肺組織炎癥病理觀察情況

正常組：小鼠肺組織支氣管內及周圍無明顯炎性細胞浸潤，組織黏膜未見充血水腫，肺泡間隔狹窄，肺泡腔清亮寬敞。模型組：支氣管壁、管腔內及血管、支氣管周圍有炎性細胞浸潤，支氣管黏膜水腫、增厚、上皮脫落、微血管滲漏、管腔內分泌物增多，基層細胞增生、平滑肌增厚，組織黏膜充血水腫，肺泡間隔變寬，肺泡腔變狹窄。LT低濃度組：肺組織嗜酸性粒細胞及其他炎性細胞浸潤減少，管壁和平滑肌厚度減少，組織充血水腫現(xiàn)象減輕，肺泡腔變寬，肺泡間隔變窄。LT高濃度組：大鼠肺組織支氣管內及周圍炎性細胞浸潤明顯減少，管壁完整，組織黏膜充血水腫減少，肺泡間隔狹窄，肺泡腔清亮寬敞。

3.4 肺組織TLR4、NF-KB的mRNA表達

PCR 檢測肺組織TLR4、NF-κB 的RNA 表達，模型組TLR4、NF-κB 的RNA 表達明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；LT 低濃度組、LT 高濃度組TLR4、NF-κB 的RNA 表達表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 肺組織TLR4、NF-KB的mRNA表達

3.5 肺組織TLR4、NF-κB pP65的蛋白表達

WB 檢測肺組織TLR4、NF-κB pP65 的蛋白表達，模型組TLR4、NF-κB pP65蛋白表達明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；LT 低濃度組、LT 高濃度組TLR4、NF-κB pP65 蛋白表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 肺組織TLR4、NF-κB pP65的蛋白的表達

4 結論

哮喘是兒童常見的慢性呼吸道炎癥性疾病，其特征是氣道高反應性、間歇性氣道阻塞和肺功能降低，其主要是以Th2 細胞為主介導的自身免疫性疾病［6］。研究發(fā)現(xiàn)，OVA 能明顯誘導小鼠哮喘的氣道高反應，而LT 能有效改善OVA 誘導哮喘模型的氣道高反應。IL-4 主要由活化的Th2細胞產生，能增強B 細胞作用，促進IgE 介導的免疫應答，誘導氣道的炎癥［7］。IL-2 主要由活化的Th1細胞產生的促進T 細胞增殖、分化的細胞因子，抑制Th2 的表達，減少促炎細胞因子和趨化因子的表達［8］。研究者發(fā)現(xiàn)OVA 能誘導小鼠哮喘模型IL-4 的產生、抑制IL-2 的形成，而LT能抑制細胞因子IL-4 的表達，而促進IL-2 的表達，說明其可能夠調節(jié)哮喘模型Th1/Th2平衡，而LT組肺部病理炎癥明顯改善，LT具有抑制哮喘炎癥的作用。

哮喘是一種以氣道炎癥為特征的過敏性疾病，暴露的過敏原會引發(fā)與Th2反應相關的氣道炎癥，誘導嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，從而促進各種炎癥介質和細胞因子的釋放［9］。TLR4 是一種重要的免疫模式識別受體，調控先天性和適應性免疫反應，促進細胞因子的合成和釋放，促進炎癥反應的產生［10］。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖加重肥大細胞過敏性氣道炎癥是通過激活肥大細胞中的TLR4 介導的，而TLR4 又反過來刺激Th2 反應［10］。TLR4/NF-κB下游通路能調節(jié)脂多糖刺激的肥大細胞產生Th2細胞因子［11］。TLR4信號啟動NF-κB的激活，誘導基因轉錄和多種炎癥介質的表達。NF-κB是參與所有類型細胞過程的必需轉錄因子復合物，包括細胞代謝、趨化性等，NF-κB在調節(jié)免疫應答以及細胞增殖和分化方面也有重要作用［12］。因此，TLR4/NF-κB信號通路對哮喘的免疫調節(jié)過程至關重要，是哮喘的重要病理機制。NF-κB pP65 是NF-κB 家族中的主要活性蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)OVA 能誘導哮喘哮喘TLR4/NF-κB 相關蛋白的表達，與文獻報道一致。 本研究發(fā)現(xiàn)木犀草素治療組能抑制TLR4、NF-κBpP65 蛋白的表達，說明木犀草素可能通過TLR4/NF-κB途徑抑制哮喘的炎癥反應。

綜上所述，LT 對哮喘具有抗炎作用，很可能與調控TLR4/NF-κB途徑有關。