基于有氧糖酵解的天然小分子抑制劑的研究進展

羅煜瑾，戴子琦，徐 冰，雷海民

北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

惡性腫瘤仍是目前嚴重威脅人類生命和健康的重要疾病。腫瘤細胞表現出異常的能量代謝特征，其即使在氧氣充足的環境里，仍使用糖酵解的方式來提供能量，腫瘤細胞中大約有50%的ATP是通過有氧糖酵解途徑合成的。腫瘤細胞不僅能夠利用糖酵解通路的中間產物為合成代謝提供原料，而且糖酵解途徑導致的乳酸增加可以為腫瘤細胞提供了一個酸性成長環境，有利于其浸潤和轉移[1-4]。腫瘤細胞中糖酵解活躍的機制復雜，其有多種因素綜合作用引起的，主要包括有利于糖酵解的跨膜結構、糖酵解關鍵酶代謝異常、癌基因及信號傳導通路異常等，而調整糖酵解酶，是糖酵解活性增強、過表達的最主要途徑。研究表明葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)可促進葡萄糖在細胞膜上的轉運，而丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、丙酮酸激酶(PKM)、己糖激酶(HK)均為糖酵解過程的關鍵限速酶，且在肝癌、肺癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤上高表達[5,6]。此外抑制有氧糖酵解可以有效抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡；通過改變缺氧誘導的代謝開關，靶向這些特定的酶來降低腫瘤細胞的活性，從而逆轉Warburg效應已成為了抗腫瘤的重要途徑[7]。

研究表明，葡萄糖轉運體(GLUT)家族14個成員都能轉運己糖和多元醇。GLUT1～5在各種組織和細胞類型中都具有葡萄糖和/或果糖轉運蛋白的作用。有氧糖酵解的代謝過程(見圖1)表明，在大部分腫瘤中缺氧的微環境能夠誘導GLUT1的高表達，進而提高腫瘤細胞對葡萄糖的攝取能力，該過程是腫瘤細胞產生Warburg效應的基礎。己糖激酶(HK)是糖酵解過程中的第一個限速酶，磷酸果糖激酶1(PFK1)是糖酵解過程中的第二個限速酶，其活性被磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶(PFKFB3)調控，丙酮酸激酶(PK)有4種同工酶，分別是M1、M2、L和R型，是糖酵解過程中的第三個限速酶，其中PKM2在腫瘤組織中廣泛高表達。而乳酸脫氫酶(LDH)催化糖酵解過程中的最后一步——乳酸和丙酮酸的相互轉化過程[8,9]。腫瘤細胞主要表達乳酸脫氫酶亞型LDHA，LDHA在腫瘤中升高除了促進糖酵解，還可以促進乳酸的產生從而重塑腫瘤微環境[1-3,10]。本文對以上相關蛋白及其天然小分子靶向抑制劑的研究最新進展及作用機理進行總結，為相關領域研究提供參考。

圖1 有氧糖酵解過程Fig.1 Aerobic glycolysis process

1 有氧糖酵解相關蛋白及其小分子抑制劑

1.1 葡萄糖轉運蛋白(glucose transports，GLUTs)及其抑制劑

腫瘤細胞糖酵解的第一個限速步驟是葡萄糖在GLUT的幫助下通過細胞膜進入細胞進行氧化[11]。葡萄糖轉運體是一種跨膜糖蛋白，它分布在細胞膜上，介導葡萄糖在細胞膜兩側的跨膜轉運。相比于正常細胞的氧化磷酸化，腫瘤細胞的有氧糖酵解是一種低效能的能量代謝方式。因此，為了滿足快速生長的需求，腫瘤細胞增加了GLUT1的表達，增加了葡糖的吸收，為其能量代謝提供了豐富的原料，從而促進其自身的增殖和浸潤。在目前已發現的14種GLUTs亞型中，GLUT1在多種癌癥中呈異常高水平表達，包括肝、結腸、卵巢等癌癥，表達水平均達到甚至超過50%。研究表明GLUT1在人腸腺癌細胞、胃癌、肺癌等腫瘤細胞系的表達量顯著高于正常細胞系[12-14]，其表達水平的升高在腫瘤細胞的分化和自我更新中起關鍵作用[15-17]。

Hsieh[18]和Zhou等[19]發現黃酮類化合物根皮素(phloretin，1，見圖2)可以通過抑制GLUT直接誘導癌細胞的凋亡。低劑量的根皮素與化療藥物聯用可以顯著提高其抗腫瘤效果。除此之外，天然黃酮類化合物中，Zhan[20]發現水飛薊賓(silybin，2)也具有GLUT抑制作用。芹黃素(apigenin，3)一種廣泛存在于水果中的黃酮類化合物，研究表明其具有良好的抗腫瘤活性，在低氧條件下，芹黃素的抗卵巢癌活性可能與其抑制HIF-1α的合成進而下調SKOV3的GLUT1的表達發揮抗腫瘤活性[21]。

圖2 GLUTs抑制劑結構Fig.2 Structures of GLUTs inhibitors

青蒿素是一種由中國科學家從青蒿中提取分離得到的倍半萜內酯類化合物，其不僅具有極好的抗瘧活性，而且其還能顯著抑制多種惡性腫瘤的增殖。Li等[22]研究顯示其衍生物雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，4)調節糖酵解抑制癌細胞生長，通過下調GLUT1和PKM2的表達發揮抗腫瘤活性，同時其與其他抗腫瘤藥物不產生交叉耐藥性。

近年研究發現，白花丹素(plumbagin，5)具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移的活性，可呈濃度和時間依賴性地通過阻斷PIK3/AKT信號通路來抑制直腸癌細胞中GLUT1的表達，從而發揮抗直腸癌活性[23]。

也有研究表明天然糖類具有抑制GLUT1的作用，Chang等[24]研究發現，銀杏多糖和銀杏外種皮多糖能夠從轉錄水平上抑制GLUT1基因表達從而抑制乳腺癌細胞4T1增殖。Wang等[25]研究發現，甘露糖(mannose，6)可在一定劑量范圍內通過抑制直腸癌細胞內GlUT1的表達，體外抑制結直腸癌細胞HCT116的增殖。

1.2 己糖激酶(hexokinase，HK)及其抑制劑

己糖激酶是腫瘤細胞有氧糖酵解的第一個關鍵的速度限制酶[26]，負責催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，促進有氧糖酵解，為戊糖磷酸途徑提供原料[27]。HK家族有四種亞型，包括HKI～IV，研究發現HK II在肝癌、結腸癌和卵巢癌等多種腫瘤細胞中高表達；與惡性腫瘤細胞的異常能量代謝和增殖中起著關鍵作用，其能抑制促凋亡因子的釋放，有利于腫瘤細胞逃逸凋亡，促進腫瘤的發展[28-30]。通過有效抑制HK II的活性進而抑制腫瘤細胞的有氧糖酵解，誘導腫瘤細胞凋亡，能有效殺死腫瘤細胞。靶向HK II的治療惡性腫瘤的策略可以分為抑制HK II的活性、抑制HK II的表達、抑制HK II與線粒體結合[31-35]。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG，7，見圖3)為2-OH被氫取代的葡萄糖類似物，能與葡萄糖競爭HK II；HK II可以將其磷酸化生成2-脫氧-D-葡萄-6-磷酸酯(2-DG-P)，而2-DG-P則無法被代謝，在機體內蓄積，因此其能顯著性抑制細胞糖酵解，使細胞內ATP耗竭，破壞蛋白質N糖基化，進而殺死腫瘤細胞[10,36]。

圖3 HK II抑制劑結構Fig.3 Structures of HK II inhibitors

小檗堿又名黃連素(berberine，BBR，8)，來源于小檗科、罌粟科、蕓香科、防己科等的一種異喹啉類生物堿。近年來，許多研究表明其對多種腫瘤具有抑制作用。Ren[37]研究發現BBR通過抑制乳腺癌細胞HK2的表達，從而影響腫瘤細胞糖酵解的發生進而抑制乳腺癌細胞的增殖。Wu等[38]發現BBR對A549的增殖活性的影響與其劑量相關，在高濃度下其通過抑制A549的EMT過程抑制腫瘤細胞遷移，并顯著下調HK II的基因表達,BBR對于EMT的抑制作用具有HK II依賴性。

麥冬皂苷B(ophiopogonin B，OP-B，9)是由麥冬中分離出的單體物質，可抑制多種癌癥細胞株的增殖活性。Bai等[39]研究發現OP-B可直接抑制HK II蛋白的表達，并上調人肺癌A549細胞中促凋亡蛋白BAX表達。當HK II活性較低時，BAX與線粒體外膜通道蛋白VDAC結合增多，從而削弱A549的增殖能力。

薯蕷次苷A(prosapogenin A，PSA，10)是來源于中藥藜蘆中的單體化合物，Wang等[40]的研究發現PSA可明顯抑制人乳腺癌MCF7細胞株的增殖，通過下調轉錄因子STAT3進而明顯降低MCF7中HK II的水平，從而抑制其糖酵解過程使細胞增殖活性明顯降低。

白頭翁皂苷(Pulsatilla chinensis，11)為中藥白頭翁中具有抗腫瘤活性的主要成分。Luo等[41]研究表示高劑量白頭翁皂苷可通過抑制HK II表達明顯降低腫瘤組織中HK II的水平，降低糖酵解的速度從而抑制肝癌細胞的增殖。

20(S)-人參皂苷Rg3(20(S)-ginsenoside Rg3，12)是中藥人參的藥理活性成分之一，研究表明其可通過調節己糖激酶2(HK II)和丙酮酸激酶M2(PKM2)抑制卵巢癌細胞的糖酵解，其與抗腫瘤藥物順鉑聯合應用可顯著增強順鉑類藥物的抗癌作用，降低其耐藥性，減小其毒副作用[42-44]。

白藜蘆醇(resveratrol，13)是存在于桑樹和花生等植物中非黃酮類多酚化合物，研究發現白藜蘆醇在體內外均對非小細胞肺癌(NSCLC)表現出很強的抑制作用，其可通過Akts信號通路介導，降低NSCLC中HK II表達，抑制了糖酵解的發生，從而抑制NSCLC的增殖[45-47]，此外白藜蘆醇也可減輕肝細胞癌HCC對索拉非尼的耐藥性[48,49]。此外研究表明其二甲基衍生物紫檀芪亦可通過STAT3/HK2途徑抑制糖酵解進而抑制卵巢癌細胞增殖[50]。

除此之外，姜黃素[51](curcumin，14)、茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate，15)可通過影響VDAC與HK2的相互作用從而抑制癌癥細胞的生長。漢黃芩素(wogonin，16)可抑制缺氧介導的PI3K/AKT、HIF-1α信號通路活化，減少細胞葡萄糖攝取，抑制糖酵解酶HK2、PDK1和LDHA表達進而抑制腫瘤糖酵解[52]。此外研究表明千層紙素A(oroxylin A，17)依賴于SIRT3去乙酰化親環素D抑制HK2與線粒體VDAC結合，降低癌細胞的ATP水平發揮抗腫瘤作用[53,54]。

1.3 丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)及其抑制劑

丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)是一種限制細胞氧化磷酸化第一階段的酶。它負責將糖酵解產物丙酮酸催化轉化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A被引入三羧酸循環，生成ATP供細胞使用。PDK催化PDH磷酸化，抑制氧化磷酸化，使得腫瘤細胞能夠適應缺氧環境，加強有氧糖酵解供能，從而促進腫瘤發展[10,55]。越來越多研究顯示PDK在腫瘤細胞及其耐藥株中受到原癌基因、轉錄因子及生長因子等的調節異常高水平表達，進而促進腫瘤細胞的增殖并獲得耐藥[56-61]。因此，PDK可成為一個新的殺死腫瘤細胞并提高化療療效靶點，若能抑制PDK的活性，使其不能催化丙酮酸脫氫酶磷酸化，進而促進葡萄糖氧化代謝途徑，誘導腫瘤細胞的凋亡，就能達到抗腫瘤的目的。

目前文獻報道了多種結構類型的PDK抑制劑，但是表現出理想的抗腫瘤作用的化合物卻并不多，其中活性最理想的是氯代羰基類的二氯乙酸(dichloroacetic acid，DCA)(化合物18，見圖4)，其也是目前唯一進入II期臨床的PDK抑制劑[57]。研究表明DCA是作為小分子化合物，其能夠很好滲透組織，甚至進入大腦，具有較高的生物利用度。大量臨床前體內外活性評價表明DCA可以其可通過抑制PDK活性而對膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌和子宮內膜癌等惡性腫瘤表現出良好的殺傷力[10,60-62]。Sun等[63]設計出一系列PDK的共價抑制劑，其中JX06(19)在A549異種移植瘤模型中通過作用于細胞內的PDK半胱氨酸殘基附近的結合位點，從而使酶的構象發生改變，降低與ATP的結合能力，從而抑制腫瘤的生長。

圖4 PDK II抑制劑結構Fig.4 Structures of PDK II inhibitors

隨著傳統中藥研究的深入，人們發現它們含有的一些活性成分也可以通過抑制PDK活性發揮抗腫瘤作用。Lee等[64]發現桂皮的水提物中活性成分肉桂酸(trans-cinnamic acid，20)能夠抑制PDK，促進線粒體的氧化磷酸化，增加ROS的生成，并且通過ROS和線粒體依賴的凋亡途徑誘導細胞發生凋亡，而對正常細胞表現出較低的細胞毒性。Tangchirakhaphan等[65]研究發現番荔枝科植物中的抗癌活性成分goniothalamin(21)可以通過同時抑制PDK和AKT的活性起到抑制黑色素瘤細胞的增殖并誘導其凋亡的作用。Chung等[66]發現草玉梅中的有效成分可以通過抑制PDK1的活性，降低PDH的磷酸化，增加ROS的產生并誘導線粒體損傷，殺傷小鼠肺癌細胞。Kwak等[67]研究表明Huzhangoside A(22)可以通過抑制PDK的活性，降低多種人癌細胞株的細胞活力。Song等[68]發現紫云英苷(astragalin，23)能夠抑制PDK的表達，激活線粒體介導的凋亡通路促進卵巢癌細胞凋亡。

1.4 丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)及其抑制劑

丙酮酸激酶也是腫瘤細胞有氧糖酵解過程中的一種重要的限速酶，其是去磷酸化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenol pyruvate，PEP)后異構為丙酮酸的催化劑，從而累積大量丙酮酸，促進磷酸戊糖途徑以及磷脂和氨基酸等的合成途徑并降低細胞內NADPH的水平，促進腫瘤細胞增殖[10,69]。PK存在四種異構體，分別是L型丙酮酸激酶、R型丙酮酸激酶、M1型丙酮酸激酶和M2型丙酮酸激酶，其中PKM2是胚胎表型，主要表達胚胎細胞等在合成代謝需求量高的分裂細胞中表達但它會在分化過程中逐步轉化為其他亞型。此外成熟組織或細胞發生重新獲得無限增殖的能力的時候，也將再次重新表達PKM2[70,71]。研究發現當細胞發生癌變時，穩定表達的其他類型的異構體會重新轉變成PKM2，而腫瘤細胞內高表達的PKM2會進一步促進腫瘤細胞的異常能量代謝并參與和調控其他與腫瘤增殖有關的基因和信號通路，促進腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移。因此，PKM2現已成為腫瘤治療的重要靶標[72-77]。

目前研究表明，紫草素(shikonin，24，見圖5)是PKM2最有效且特異性最高的抑制劑，其能夠顯著抑制高表達PKM2腫瘤細胞的糖酵解速率，殺傷腫瘤細胞的同時逆轉耐藥[78,79]。Tang和Tao等[80,81]發現紫草素通過抑制PKM2的表達抑制食管癌和膀胱癌的進展并誘導細胞凋亡。無獨有偶，萘醌類化合物—維生素K，一種人體必需的脂溶性維生素，在臨床上主要用作凝血劑。近年來，體內外研究顯示維生素K也有抑制PKM2發揮抗腫瘤的作用，特別是維生素K3(vitamin K3，25)和K5(vitamin K5，26)。Chen等[82]發現，維生素K3和K5對PKM的抑制作用明顯高其對于PKM1和PKL。更有研究顯示維生素K3和K5對結腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞和組織的殺傷效果顯著強于維生素K1和K2。

圖5 PK抑制劑結構Fig.5 Structures of PK inhibitors

Wei等[83]在中藥茜草提取物的結構基礎上合成了FFJ-5(27)，經研究發現其能下調PKM2，抑制MCF7、A549、HepG2的生長并逆轉MCF7耐藥細胞對化療藥多柔比星的耐藥性。Zhao等[84]發現穿心蓮有效部位AEP可通過抑制PKM2和脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)的表達誘導腫瘤細胞凋亡及壞死。

在中藥方劑方面，Zhu等[85]發現白露湯能通過抑制GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A、HIF-1ɑ的表達調控，從而調控人肺腺癌A549糖酵解過程，表現出對人肺腺癌A549明顯的抑制作用并恢復其對化療藥物順鉑的敏感性。燈盞花乙素(scutellarin，28)是黃酮類天然化合物，研究表明其可直接靶向抑制PKM2，降低其胞漿活性從而抑制糖酵解代謝發揮抗結腸癌作用，此外其還可通過激活MEK/ERK/PIN1途徑參與細胞周期和凋亡過程的調節，促進PKM2的核轉位[86]。

丹參酮中的有效成分丹參酮IIA(tanshinoneIIA，29)和隱丹參酮(cryptotanshinone，30)均具有顯著的抗腫瘤活性，Zhang等[87]研究顯示，丹參酮IIA可通過上調miR-122通過抑制食道癌細胞中PKM2的表達發揮抗腫瘤活性；隱丹參酮可以通過靶向抑制PKM2/β-catenin信號的表達發揮抗乳腺癌作用[88]。6-姜烯酚(6-gingerol，31)可以通過調控人胃癌BGC-823細胞中PKM2磷酸化干擾癌細胞能量代謝過程以發揮抗胃癌功效[89]。

有研究發現，三環倍半萜類化合物廣藿香醇(patchouli alcohol，32)可以誘導MVP細胞的凋亡，其主要機制是下調磷酸化酶PKM2并抑制核轉錄因子NF-κB活性而發揮作用[90]。

五環三萜類成分齊墩果酸(oleanolic acid，33)具有良好的抗腫瘤活性，其抗癌活性可能與PKM2/PKM1介導抑制有氧糖酵解相關，且在齊墩果酸處理的癌細胞處發現被滅活的雷帕霉素靶蛋白mTOR，而mTOR與誘導PMK2/PMK1直接相關[91]。

除此之外，天南星水提物蟾毒靈[92](bufalin，34)、蛇葡萄素[93](ampelopsin，35)和苦參堿[94](matrine，36)對于癌癥細胞的抑制作用也均與mTOR/PMK信號通路直接相關。

大黃提取物中的蒽醌類有效成分大黃素(emodin，37)可明顯降低HepG2細胞中PKM2，HK2等的表達水平有效抑制其增殖活性[95]。大黃素抑制胃癌細胞MGC803細胞生長的機制與抑制細胞外信號調節激酶ERK1/2和PKM2的表達，促進凋亡因子p53表達相關[96]。

Feng等[97]研究發現二聚體黃酮原花青素B2(proanthocyanidin B2，38)可通過抑制PKM2表達和核轉位阻斷PKM2/HSP90/HIF-1α的相互作用，進而抑制肝癌細胞有氧糖酵解而發揮抗腫瘤作用。

1.5 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及其抑制劑

乳酸脫氫酶是細胞糖酵解最后階段的一種關鍵的速度限制酶，其能催化NADH和丙酮酸發生氧化還原反應生成乳酸和NAD+，對形成腫瘤中具有重要作用[10]。乳酸脫氫酶由4個亞基構成，分別為兩個M亞基(muscle-type，LDHA)和2個H亞基(heart-type，LDHB)，其中LDHA亞基在有氧糖酵解里發揮關鍵性作用[98]。許多研究表明LDHA在胰腺癌、骨髓瘤和前列腺癌等腫瘤細胞中表達異常高[99-101]。Fantin等[102]研究發現用當用siRNA敲除LDHA的表達時，在低氧條件下細胞呼吸受到抑制，線粒體膜電位降低，腫瘤細胞擴增能力降低。Le等[103]發現用腫瘤細胞經siRNA或FX11處理后，LDHA的活性受到抑制，ATP的生成減少，并且發生氧化應激反應，最終導致細胞死亡。不僅如此，Zhou等[104]還觀察到紫杉醇耐藥乳腺癌細胞中LDHA的表達和活性增加，siRNA對LDHA表達的降解顯著恢復了紫杉醇耐藥細胞的敏感性。很明顯，LDH現在可以成為腫瘤診斷和治療的關鍵目標。

LDH的抑制劑主要是丙酮酸類似物或者NADH類似物，該類化合物通過發揮競爭性抑制作用遏制腫瘤細胞能量代謝，殺死腫瘤細胞的同時逆轉耐藥。草氨酸(oxamate,39，見圖6)作為LDH的特異性抑制劑，其是丙酮酸的結構類似物[10,104-106]。根據Zhou等[104]的研究顯示草氨酸通過抑制LDH使丙酮酸無法轉化為乳酸，抑制糖酵解，進而促進乳腺癌細胞的凋亡；同時與紫杉醇聯用對腫瘤細胞有很好的協同抑制作用。FX-11(40)是和NADH競爭的LDH的選擇性可逆抑制劑，在淋巴瘤和胰腺癌異種移植物中表現出明顯的抗腫瘤活性[107]。

圖6 LDH抑制劑結構Fig.6 Structures of LDH inhibitors

中藥雷公藤中的活性成分雷公藤紅素(celastrol，41)對于人肺癌細胞A549具有體外抑制作用，研究表明其能通過下調LDHA的表達抑制腫瘤細胞有氧糖酵解[108]。與之類似，光甘草定[109](glabridin，42)和甜菜堿[110](betaine，43)也通過抑制LDHA的表達發揮抑制作用。

2 小結與展望

有氧糖酵解作為腫瘤細胞特異的能量代謝特征，不僅為腫瘤細胞的增殖提供了能量和物質供應，同時酵解途徑導致的乳酸增加還為腫瘤細胞提供了一個酸性成長環境而利于其浸潤和轉移。本文通過對現有研究發現的天然來源靶向腫瘤糖酵解關鍵酶的小分子抑制劑進行總結，直觀地體現其結構并為結構改造提供新思路，以期為更有效地開發利用天然產物中的抗腫瘤活性成分，對逆轉腫瘤的多藥耐藥，改善常規化療的治療效果，提高腫瘤對化療藥物的敏感性等多個抗腫瘤方面的研究提供靈感。