基于柱前衍生化GC-MS技術探究紫蘇葉與白蘇葉的質量差異

陳家寶，楊貴雅，郭 龍，齊琳琳，溫春秀，鄭玉光，王 蕾*

1河北中醫學院藥學院；2河北省中藥炮制技術創新中心；3河北省中藥資源利用與質量評價國際聯合研究中心，石家莊 050200；4河北省農林科學院經濟作物研究所，石家莊 050051；5河北化工醫藥職業技術學院，石家莊 050026

紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.為唇形科紫蘇屬一年生直立草本植物[1]。歷代重要本草稱葉兩面全紫或面青背紫的為“蘇”或“紫蘇”，而將葉片全綠的稱為“荏”，即“白蘇”[2]。二者皆可作為蔬菜食用，但在使用過程中仍有一些區別。紫蘇因富含天然色素廣泛應用于天然食品著色劑領域[3]，參考《中國藥典》(2020版)中對紫蘇葉藥材的“兩面紫或上表面綠色，下表面紫色”的性狀描述，可知紫蘇則為正品紫蘇類藥材的植物來源[4]。白蘇除了作為蔬菜食用，還可用作食品防腐劑[5]。20世紀70年代《中國植物志》參考國外分類學家Elmer Drew Merrill的意見將“紫蘇”和“白蘇”合并為一種，稱該原變種為P.frutescensvar.frutescens[1]。20世紀80年代，國內中醫藥學者基于對紫蘇和白蘇本草考證及功效差異的考量，建議將“紫蘇”定名為P.frutescensvar.arguta，“白蘇”定名為P.frutescensvar.frutescens.[6-8]，并且Liu等[9]根據野外觀察和栽培試驗發現紫蘇種子播種后仍全部為紫蘇，白蘇種子播種后其葉全部為兩面綠的白蘇，未發現變異?？梢?，紫蘇在植物分類上至今仍存在一定的爭議，需相關學者不斷尋找可靠、普遍適用的特征作為紫蘇與白蘇分類的依據。

紫蘇葉為紫蘇P.frutescens(L.) Britt.的干燥葉(或帶嫩枝)，具有解表散寒，行氣和胃的功效，常用于治療風寒感冒，咳嗽嘔惡，妊娠嘔吐，魚蟹中毒[4]。既然《中國植物志》將紫蘇與白蘇合并為一種，那么紫蘇葉的來源植物也應包括白蘇，然而白蘇葉與紫蘇葉在外觀形態、化學成分等方面二者存在較大差異。Li等[10]收集了來自國內各地的不同紫蘇種質，種植后觀察記錄形態特征并采用GC-MS技術確定其化學型，結果顯示白蘇葉多為兩面綠色、PK(紫蘇酮)型，紫蘇葉多為兩面紫色、PA(紫蘇醛)型，二者的葉片大小、葉片平整度、葉片邊緣等形態特征存在明顯差異；Dai等[11]利用HPLC技術對紫蘇葉與白蘇葉中酚酸類物質的含量進行了比較，發現紫蘇葉中原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸與迷迭香酸的含量均高于白蘇葉；Shangguan等[12]采用可見分光光度法比較紫蘇葉和白蘇葉中的總黃酮的含量差異，結果表明紫蘇葉中的總黃酮含量高于白蘇葉；Huang等[13]利用HPLC技術比較分析了紫蘇葉與白蘇葉中的迷迭香酸的含量，發現在同一采收期紫蘇葉中迷迭香酸的含量高于白蘇葉。目前對紫蘇葉與白蘇葉化學成分差異的研究主要集中于揮發油、黃酮、酚酸等成分，尚缺乏對二者氨基酸、有機酸、糖類等成分含量差異的研究，有必要更加系統全面地分析紫蘇葉與白蘇葉的差異性。

本研究擬以紫蘇葉與白蘇葉為研究對象，建立柱前衍生化GC-MS分析方法，測定二者氨基酸、有機酸、糖類、脂肪酸、酚酸類等成分的含量；并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)等多元統計分析方法比較二者化學成分差異，篩選出差異性標志物；通過系統研究紫蘇葉與白蘇葉化學成分差異，將為紫蘇植物學分類及紫蘇不同種質資源應用提供一定參考。

1 材料

Agilent 7890B-5977B型GC-MS儀(美國Agilent公司)；SQP型十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Eppendorf 5418型高速臺式離心機(艾本德中國有限公司)；DUO型GeneVac miVac真空離心濃縮儀(上海德祥科技有限公司)；MTH-100型恒溫混勻儀(杭州米歐儀器有限公司)。

甲醇(美國飛世爾科技中國有限公司，純度≥99.9%)；甲酸(美國ROE SCIETIFIC INC，純度≥99%)；水(Milli-Q系統制備超純水)；水楊酸(上海羅恩試劑公司，純度≥99.5%)；無水吡啶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥99.8%)；甲氧胺鹽酸鹽(美國Sigma Aldrich公司，純度≥97.5%)；衍生化試劑MSTFA[N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺](美國Sigma Aldrich公司，純度≥98.5%)；氨基酸混標(日本和光純藥株式會社(WAKO)，批號：KCN6130，內含L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸)；有機酸混標(天津阿爾塔科技有限公司，批號：S051847，內含乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸)；單糖混標(天津阿爾塔科技有限公司，批號：S029641，內含D-果糖、D-葡萄糖、D-蔗糖、D-麥芽糖、D-乳糖)；棕櫚酸(天津阿爾塔科技有限公司，批號：1ST1714，純度≥99.9%)；油酸(天津阿爾塔科技有限公司，批號：1ST1738，純度≥99.5%)；α-亞麻酸(天津阿爾塔科技有限公司，批號：1ST1776，純度≥98.5%)；咖啡酸(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y09J8C28349，純度≥98.0%);迷迭香酸(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y06A9K67402，純度≥98.0%)。

12批紫蘇葉與10批白蘇葉均由河北省農業科學院經濟作物研究所溫春秀教授提供，經河北中醫學院鄭玉光教授分別鑒定為紫蘇P.frutescensvar.arguta及白蘇P.frutescensvar.frutescens的干燥葉，樣品存放于河北中醫學院中藥炮制技術創新中心，樣品來源信息見表1。

表1 紫蘇葉與白蘇葉樣品信息Table 1 Information of leaves of Perilla frutescens var.arguta and P.frutescens var.frutescens samples

2 方法

2.1 GC-MS條件

氣相色譜條件：以HP-5石英毛細管柱(0.32 mm×30.0 m，0.25 μm)為色譜柱，分流比為5∶1，載氣為高純氦氣，進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL，程序升溫(初始溫度從80 ℃開始，以10 ℃/min升溫到200 ℃；以6 ℃/min升到250 ℃，以10 ℃/min升溫到310 ℃，保持5 min)。

質譜條件：采用電子轟擊離子源(electron impact ion source，EI)，離子能量70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，TIC掃描質量范圍m/z50～500，溶劑延遲時間為3 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

將干燥的紫蘇葉樣品凈選后粉碎，過60目篩。分別稱取各樣品粉末0.1 g，置于1.5 mL離心管中，加入1 mL提取溶劑(甲醇-水-甲酸70∶28∶2)，充分振搖，室溫下超聲(功率300 W，頻率40 kHz)15 min。13 000 r/min高速離心10 min，取上清液50 μL，加入20 μL水楊酸(1 mg/mL)作為內標，真空濃縮90 min(40 ℃)揮干溶劑后加入20 μL甲氧胺吡啶溶液(40 mg/mL)，充分振搖，在金屬浴30 ℃下肟化90 min。接著加入80 μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)，在金屬浴37 ℃下充分反應30 min，進行硅烷化反應。最后將樣本于13 000 r/min離心10 min，取上清液，制備供試品衍生化溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

稱取或吸取氨基酸混標、有機酸混標、單糖混標、棕櫚酸、油酸、α-亞麻酸、咖啡酸、迷迭香酸對照品適量，加溶劑(甲醇-水-甲酸70∶28∶2)配制成含氨基酸混標2.5 μmol/mL、有機酸混標4.0 mg/mL、單糖混標5.0 mg/mL、棕櫚酸0.5 mg/mL、油酸2.0 mg/mL、α-亞麻酸0.5 mg/mL、咖啡酸2.0 mg/mL、迷迭香酸20.0 mg/mL的混合對照品母液。將對照品母液用溶劑(甲醇-水-甲酸70∶28∶2)逐級稀釋呈一系列梯度濃度溶液(氨基酸混標0.1562～2.50 μmol/mL、有機酸混標0.25～4.0 mg/mL、單糖混標0.3125～5.0 mg/mL、棕櫚酸0.0312～0.5 mg/mL、油酸0.125～2.0 mg/mL、α-亞麻酸0.0312～0.5 mg/mL、咖啡酸0.125～2.0 mg/mL、迷迭香酸1.25～20.0 mg/mL)，取上清液20 μL進行衍生化反應，衍生化后按“2.1”項下條件進行GC-MS分析，測定峰面積。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取紫蘇葉(Z1)供試品衍生化溶液，按照“2.1”項下條件進行GC-MS分析，連續進樣6次，記錄色譜圖。以水楊酸(內標)峰為參照峰，計算各代謝物的相對保留時間和相對峰面積，結果各代謝物相對保留時間RSD≤0.07%(n=6)，相對峰面積的RSD在0.53%～2.13%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

取紫蘇葉(Z1)供試品衍生化溶液，分別于室溫密封條件下在0，2，4，8，12，24 h進樣分析，以水楊酸(內標)色譜峰為參照峰，計算各對照品衍生物的相對保留時間和相對峰面積，結果各對照品衍生物相對保留時間RSD≤0.16%(n=6)，相對峰面積的RSD在0.83%～2.06%(n=6)，表明供試品衍生化溶液在24 h之內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗

取紫蘇葉(Z1)樣品粉末6份，每份0.1 g，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品衍生化溶液，按照“2.1”項下條件進行GC-MS分析，以水楊酸(內標)色譜峰為參照峰，計算各對照品衍生物的相對保留時間和相對峰面積，結果各對照品衍生物相對保留時間RSD≤0.24%(n=6)，相對峰面積的RSD在0.53%～2.01%(n=6)，表明所建方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗

取已知含量的紫蘇葉或白蘇葉樣品粉末6份，每份0.05 g，分別加入混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品衍生化溶液，進行GC-MS分析，計算含量。結果顯示各對照品衍生物的平均加樣回收率在96.73%～104.61%(n=6)，RSD在0.93%～2.55%(n=6)，表明所建的含量測定方法準確性良好，結果見表2。

表2 加樣回收率考察結果Table 2 Recovery test results of the samples

續表2(Continued Tab.2)

2.4 數據處理與分析

數據經過Qualitative Navigator(B.08.00)軟件分析并與NIST17標準質譜檢索庫進行檢索比對，對各色譜峰進行定性分析；利用Quant Analysis(B.09.00)批處理軟件提取各樣品中對應峰的峰面積；利用多元變量統計分析軟件SIMCA 14.1進行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)篩選出差異性代謝物(VIP>1，P<0.05)；采用Origin 2018軟件繪制相關圖形。

3 結果與討論

3.1 定性分析

將“2.2.1”與“2.2.2”項下所得到的供試品與對照品衍生化溶液按“2.1”項下實驗條件進樣分析，得到紫蘇葉和白蘇葉樣品GC-MS總離子流圖(見圖1A、1B)與對照品GC-MS總離子流圖(見圖1C)。采用Qualitative Navigator(B.08.00)軟件對樣品代謝產物的總離子流圖進行匹配。結果，共得到58個特征峰(包含內標水楊酸)，約占總峰面積90%。通過將各峰質譜圖與NIST17.0數據庫進行檢索比對，鑒別得到58個特征峰所對應的代謝產物(見表3)，分別屬于有機酸類、糖類、氨基酸類、脂肪酸類等。

圖1 基于柱前衍生化的紫蘇葉(A)與白蘇葉(B)樣品及混合對照品(C)GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms (TIC) of leaves of P.frutescens var.arguta (A) and P.frutescens var.frutescens (B) and reference substance (C) by GC-MS after pre-column derivatization

表3 紫蘇葉與白蘇葉代謝產物相關信息Table 3 The information of metabolites in leaves of P.frutescens var.arguta and P.frutescens var.frutescens

續表3(Continued Tab.3)

3.2 差異性化合物的篩選

為比較紫蘇葉和白蘇葉化學成分差異，采用Quant Analysis(B.09.00)批處理定量分析軟件積分并提取所有樣品中所鑒定的代謝產物的峰面積并進行相對含量分析，將共有化合物的峰面積合并歸一化后的數據導入SIMCA 14.1軟件中進行無監督的主成分分析(PCA)。主成分分析結果顯示紫蘇葉(Z1～Z12)與白蘇葉(B13～B22)明顯分布于2個區域(見圖2A)，提示紫蘇葉和白蘇葉中代謝產物的含量存在一定差異性。為了進一步區分紫蘇葉和白蘇葉，尋找二者之間關鍵差異性成分，在進行了無監督的主成分分析的基礎上，進一步對樣品數據進行了有監督的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。建立的偏最小二乘法判別分析模型中，累計解釋能力參數R2Y與Q2分別為0.981、0.957，提示所建立的模型穩定性和預測能力較好，可用于區分紫蘇葉和白蘇葉樣品。OPLS-DA得分圖與主成分分析結果一致，紫蘇葉和白蘇葉可以較好地分為2類(見圖2B)。進一步根據OPLS-DA模型中各化學成分的變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)預測值來篩選差異性化合物。一般認為在95%的置信區間內，VIP>1.0的化合物在2組分類中發揮著重要作用。在此基礎上，比較各成分在紫蘇葉及白蘇葉中的平均相對含量是否存在顯著性差異(P<0.05)，基于上述標準，從鑒別出來的代謝物中篩選得到8個差異性代謝物，分別為D-阿拉伯糖醇(峰27，VIP=1.109，P<0.001)、D-果糖(峰32，VIP=1.509，P<0.001)、D-半乳糖(峰33，VIP=1.022，P<0.001)、D-葡糖醇(峰37，VIP=1.483，P<0.001)、D-山梨糖醇(峰38，VIP=1.236，P<0.001)、咖啡酸(峰43，VIP=2.022，P<0.001)、麥芽糖(峰53，VIP=3.002，P<0.001)、迷迭香酸(峰57，VIP=4.872，P<0.001)(見圖3)。比較這8個差異性代謝物在紫蘇葉與白蘇葉中的平均含量表明，紫蘇葉中D-果糖、D-葡糖醇、咖啡酸、迷迭香酸的含量顯著高于白蘇葉，D-阿拉伯糖醇、D-半乳糖、D-山梨糖醇的含量顯著低于白蘇葉(見圖4)。

圖2 PCA(A)和OPLS-DA(B)的得分圖Fig.2 PCA (A) and OPLS-DA (B) score plots注：Z：紫蘇葉；B：白蘇葉。Note:Z:Leaves of P.frutescens var.arguta;B:Leaves of P.frutescens var.frutescens.

圖3 P值與VIP值分布散點圖Fig.3 Scatter plot of P-value and VIP value注：綠色的點代表VIP>1、P<0.05的差異性化合物。Note:Green points represent the differential compounds with VIP>1,P<0.05.

圖4 差異性代謝產物柱狀圖 Fig.4 Bar chart of significantly different metabolites 注：二者相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:Both compared with each other,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3.3 定量分析

3.3.1 線性關系考察

分別以對照品質量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，相應對照品衍生物的峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到各成分回歸方程。所測定的27個化學成分在各自質量濃度范圍內呈良好線性關系，R2在0.997 2～0.999 6之間(見表4)。

表4 對照品的線性回歸方程及相關系數Table 4 Linear regression equation and correlation coefficient of reference substances

3.3.2 含量測定

按照“2.2.1”項下方法制備22批樣品供試品衍生化溶液，按“2.1”項下條件進行GC-MS分析，將測定的各對照品成分的峰面積代入各回歸方程進行計算，得到樣品中各對照品成分的含量，計算紫蘇葉與白蘇葉中各成分含量的平均值見表5。其中紫蘇葉中的L-亮氨酸、L-天冬氨酸、咖啡酸、α-亞麻酸、乳糖、麥芽糖及迷迭香酸平均含量顯著高于白蘇葉；而L-谷氨酸、棕櫚酸、油酸平均含量則顯著低于白蘇葉(P<0.05)。

表5 紫蘇葉和白蘇葉中對照品成分的含量測定結果Table 5 Results of the determination of reference substances in leaves of P.frutescens var.arguta and P.frutescens var.frutescens

4 討論與結論

當前紫蘇與白蘇的分類爭議尚未解決，《中國植物志》的拉丁名將紫蘇與白蘇合并為一種，但《中國藥典》性狀描述中明確提出葉片單面紫或雙面紫，可見藥典規定的藥用紫蘇品種不包括白蘇。多年來，對紫蘇葉與白蘇葉差異性研究主要集中于次級代謝產物，目前已在紫蘇葉中分離鑒定出超過兩百種[14]化學物，主要為揮發油類(紫蘇醛、紫蘇酮等)、酚酸類(迷迭香酸、咖啡酸等)與黃酮類(木犀草素、芹菜素等)。這些成分對紫蘇葉的品質有重要貢獻[15-17]。其實，除了這些前人研究較多的次級代謝產物外，紫蘇葉中還存在一些極性較強的初級代謝產物，如糖類、氨基酸、有機酸等，對紫蘇葉品質亦有重要貢獻[18,19]。對于這些初級代謝產物的研究較少的部分原因是缺乏完善的分析方法。為了比較紫蘇葉與白蘇葉中這些成分的含量差異，本文采用了柱前衍生化GC-MS技術，該技術是在樣品進行GC-MS分析前利用化學方法將目標物質修飾成類似化合物，從而使目標化合物的極性和沸點降低，增強物質的揮發性和熱穩定性，更方便于非揮發性物質定性定量分析的一種技術。本研究所建立的紫蘇葉樣品柱前衍生化方法，條件溫和、操作簡單、樣品穩定性好、結果準確，可以用作紫蘇葉中氨基酸類、糖類、脂肪酸類、酚酸類等成分快速、高通量分析測定的方法。

紫蘇葉為傳統的藥食兩用植物。本研究對紫蘇葉與白蘇葉中多種成分的定性和定量分析結果顯示二者中均含有6種人體必需氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸)，且它們在紫蘇葉中的平均含量均高于白蘇葉，表明就氨基酸水平而言，紫蘇葉的營養價值優于白蘇葉。同時發現紫蘇葉與白蘇葉中均含有較高含量的迷迭香酸。迷迭香酸是一種天然存在的酚酸類物質，主要有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化和免疫抑制等多種活性[20-24]，比較結果顯示紫蘇葉中迷迭香酸含量顯著高于白蘇葉，提示紫蘇葉為更好的藥用植物來源。而白蘇葉中酒石酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、棕櫚酸、油酸等成分的含量高于紫蘇葉，也存在一定食用與藥用價值。上述結果表明紫蘇葉與白蘇葉的初級代謝產物存在顯著差異，在植物學分類上將紫蘇與白蘇分開，有利于紫蘇類藥材的正本清源。上述結果對于紫蘇葉的質量控制及優質紫蘇種質的篩選具有重要的意義。