基于UPLC-Q-TOF-MS技術和PLS-DA分析的五個基原綠絨蒿化學成分差異研究

李玉凰，王云紅，張成江，郭延壘，秦偉瀚，劉 翔*，陽 勇*

1重慶市中藥研究院，重慶400065；2遵義醫科大學藥學院，遵義563000

藏藥是我國四大民族藥之首，其特殊的地理環境造就了藏藥材獨特的治療效果[1]。綠絨蒿作為常用的藏藥，在《新修晶珠本草》《民族藥辭典》《藏藥部頒》《國家藏藥標準全書》《藏藥志》等藏藥典籍中均有記載。綠絨蒿屬(MeconopsisVig.)是Viguier于1814年根據康布里罌粟Papavercambricum建立的，是極具特色的高山藏藥，本屬分2個亞屬、5個組和9個系，間斷分布于東亞和西歐，為一年生或多年生草本，株高10～180 cm不等，種類不同，花型花色各不相同，綠絨蒿中的不少種類莖葉上長滿了柔長的絨毛，因此得名[2-4]。因南北學用藥不一，各地綠絨蒿屬植物在使用上和名稱上有所異同，導致藥物混淆，品種混亂、基原復雜，故綠絨蒿屬藥用植物的研究和應用面臨挑戰[5,6]。

超高液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜聯用(UPLC-Q-TOF-MS)具有高分辨率、高靈敏度和高效分離能力，可在缺少對照品的情況下對復雜中藥成分進行初步定性分析，已被廣泛用于天然藥物分析[7,8]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS對總狀綠絨蒿MeconopsisracemoseMaxim.、多刺綠絨蒿MeconopsishorridulaHook.f.&Thoms、五脈綠絨蒿MeconopsisquintuplinerviaRegel、全緣葉綠絨蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim).French.和紅花綠絨蒿MeconopsispuniceaMaxim.5個基原共49個批次綠絨蒿藥材的化學成分進行鑒定，結合主成分分析(principal component analysis，PCA)及偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination-analysis，PLS-DA)數學模型探討不同基原綠絨蒿成分差異，為綠絨蒿品種分類、物質基礎和合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

TripleTOF 4600型四極桿串聯飛行時間高分辨質譜儀(美國，ABSCIEX公司)：Peak View 1.2數據處理軟件；SIMCA-P 14.1(瑞典，Umetrics公司)。

1.2 試藥

甲醇(分析純，批號：202010101，重慶川東化工(集團)有限公司)；乙腈(色譜純，批號：1100130025，Merck)；甲酸(色譜純，批號：202674，Fisher)；水(色譜純，批號：197545，Fisher)。

1.3 藥材

本實驗用綠絨蒿全草藥材經重慶市中藥研究院生藥所劉翔副研究員采集鑒定，采集信息表見表1。

表1 綠絨蒿樣品信息Table 1 Sample information of Meconopsis

續表1(Continued Tab.1)

1.4 供試品溶液制備

取樣品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理，(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液即得。

1.5 分析方法

1.5.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為甲酸水溶液(0.1%)，流動相B為乙腈，梯度洗脫(0～3.0 min，30% B；3.0～11.0 min，30%→90% B；11.0～12.8 min，90% B；12.8～13.0 min，90%→10% B；13～15.0 min，10% B)；柱溫30 ℃；流速0.25 mL/min；進樣量3 μL。

1.5.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，分別在正、負離子模式下掃描，掃描范圍m/z：100～1 000；離子源溫度(TEMP)：600℃；正、負離子模式下噴霧電壓(IS)分別為+5.5、-4.5 kV；碰撞能量(CE)：10 eV；碰撞能量疊加(CES)：25±15 eV；去簇電壓(DP)：100 V；氣簾氣壓力(CUR)：25 psi；霧化氣壓力(GS1)：55 psi；輔助氣壓力(GS2)：55 psi；采集時間15 min。

1.6 數據處理方法

通過中國知網(CNKI)、SciFinder、PubChem、ChemSpider 等平臺或數據庫查詢綠絨蒿屬藥材中所含的化學成分，建立綠絨蒿成分的質譜數據庫，包含化合物名稱、分子式、結構、質譜信息等。將供試品溶液按“1.5.1”和“1.5.2”項下條件檢測，結合前期建立的綠絨蒿成分質譜數據庫，應用Peak View 1.2軟件中的 XIC Manager功能進行化合物初步的篩選，得化合物的分子離子峰、二級碎片離子信息及保留時間等信息，根據文獻資料、化合物Mol式匹配結果、質譜數據庫結合軟件的Formula Finder、Mass Calculators、Fragment Matching 等功能以及二級碎片裂解規律進行定性分析，進行化合物的鑒定。

1.7 PCA、PLS-DA數據處理方法

將49批綠絨蒿供試品溶液的數據結果導入 PeakView 1.2 軟件，將滿足誤差小于5 ppm，同位素分布正確且含有二級碎片的化合物確認為目標物質，結合PeakView 1.2軟件Formula Finder等功能、數據庫及二級碎片裂解規律，對綠絨蒿所含成分進行定性分析，并按化合物類別建立已知成分篩查表。將5個基原綠絨蒿的MS數據用notepad++軟件打開編輯后，轉換數據，在正離子模式下得到1 811組化合物相關數據，負離子模式下得到1819組化合物相關數據。將處理后的數據導入SIMCA-P 14.1軟件中，運用模式識別技術進行數據的可視化處理，構建PCA及PLS-DA數學模型。從整體到部分，全面分析5個基原綠絨蒿的化學成分差異、分組趨勢和相關性。

2 結果與分析

2.1 5個基原綠絨蒿中化學成分的質譜解析

通過檢測，得總離子流圖(TIC)，并以5個基原綠絨蒿各1個代表性樣品的TIC圖作代表性數據(見圖1)。結果發現多刺綠絨蒿、總狀綠絨蒿、五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿、紅花綠絨蒿的色譜圖具有一定差異性。通過對5個基原綠絨蒿在正、負離子模式下碎片離子進行對比，在正離子模式下鑒定得到了65個化合物，在負離子模式下鑒定得到了65個化合物，共鑒定出75個化合物(見表2)，其中包括生物堿類化合物16個，黃酮類化合物26個，揮發油類化合物24個，其他化合物9個。其中二氫血根堿、去甲血根堿、原阿片堿、馬齒莧酰胺、芹菜素、木犀草素、槲皮素、白屈菜堿、苜蓿素等43個化學成分為5個基原綠絨蒿中的共有成分；桂皮酰胺、阿撲嗎啡、原荷包牡丹堿、威爾士綠絨蒿定堿、脈奎寧、槲皮素-3-O-[2-O-乙酰基-α-L-阿拉伯糖(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-[2-O-乙酰基-α-L-阿拉伯糖( 1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、2-胺基-苯甲酸甲酯、二十一酸甲酯、豆甾-3,5,22-三烯、二氫刺苞菊醛、5,15-O-diacetyl-3-O-phenyl-6 ( 17 ) epoxylathyrol等在5個基原綠絨蒿中存在明顯差異，各批次綠絨蒿化學成分差異(見表3)。

圖1 不同基原綠絨蒿樣本UPLC-Q-TOF-MS正離子和負離子模式總離子流圖Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS total ion chromatograms for different origins of Meconopsis under positive ion and negative ion注：A：多刺綠絨蒿；B：總狀綠絨蒿；C：五脈綠絨蒿；D：全緣葉綠絨蒿；E：紅花綠絨蒿。Note:A:M.horridula;B:M.racemose;C:M.quintuplinervia;D:M.integrifolia;E:M.punicea.

表2 5個基原綠絨蒿樣品中化學成分分析Table 2 Analysis of chemical constituents in five origins of Meconopsis

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

表3 49個批次綠絨蒿的化學成分對照Table 3 Chemical composition control of 49 batches of Meconopsis

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

2.2 主成分分析(PCA)

基于對上述5個基原綠絨蒿TIC圖的觀察和化學成分比較，為進一步明確5個基原綠絨蒿的差異，以PCA建立不同基原綠絨蒿的分散點圖進行整體趨勢分析觀察。將5個基原綠絨蒿的MS數據用notepad++軟件打開編輯后，轉換數據，將處理后的數據導入SIMCA-P 14.1軟件中進行無監督的PCA處理(見圖2)，結果表明5個基原綠絨蒿不能各自明顯分離，正離子模式下多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿較好地聚集在一起，五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿和紅花綠絨蒿能較好地聚集在一起；負離子模式下5個基原綠絨蒿各批次較為分散，提示不同基原綠絨蒿的化學成分存在一定的差異性。

圖2 不同離子模式下5個基原綠絨蒿的PCA得分Fig.2 PCA scores of five origins of Meconopsis under different ion modes

2.3 偏最小二乘法-辨別分析(PLS-DA)

基于上述TIC和PCA結果，為充分了解5個基原綠絨蒿間的差異信息，將處理后的數據進一步進行PLS-DA模式識別，結果發現在正、負離子模式下多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿均能較好地聚集在一起；五脈綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿和紅花綠絨蒿較為分散，但仍存在一定交集，見圖3。由此可得，5個基原綠絨蒿存在差異性化學成分，可將多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿分為一類，與其余3個基原綠絨蒿明顯區分開。

圖3 不同離子模式下5個基原綠絨蒿的PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA scores of five origins of Meconopsis in different ion modes

3 討論與結論

《中華人民共和國衛生部藥品標準(藏藥)》1995年版中，分別收載了多刺綠絨蒿和綠絨蒿兩個品種，多刺綠絨蒿的來源僅1種，綠絨蒿的來源有3種：全緣綠絨蒿、五脈綠絨蒿、長葉綠絨蒿，但市場調研發現，在藏區實際應用中長葉綠絨蒿品種較少，資源較為匱乏。據報道，綠絨蒿屬植物因生長環境惡劣和人類過度開采等原因，導致綠絨蒿資源有限，部分綠絨蒿已處于瀕危狀態，作為我國瀕危保護植物[9,10]。因而對藏藥綠絨蒿進行深入研究，對品種進行整理分類，為綠絨蒿的合理開發與應用具有重要的作用。

藥物的不同臨床作用很大程度上是由于化學成分的不同導致的。根據文獻報道[11-16]，綠絨蒿屬植物中含有生物堿類、黃酮類、揮發油類、甾體類、萜類等化學成分，其中生物堿和黃酮為其主要活性成分[17]，是近年來研究的重點。有專家提出在《中華人民共和國衛生部藥品標準(藏藥)》刺爾恩的來源中增加總狀綠絨蒿這一基原，但尚未有研究報道支持此建議。本研究首次通過質譜手段對5個基原綠絨蒿的化學成分進行研究，基于本研究中鑒別出的75種化學成分，多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿有59種共有化學成分，表明多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿的化學成分種類上基本一致，與其他3個基原的綠絨蒿化學成分種類存在一定差異，此研究結果可為多刺綠絨蒿中增加總狀綠絨蒿這一基原提供科學依據。

在物質基礎方面，5個基原綠絨蒿的化學成分差異可能會對該藥材的藥效產生較大影響，建議將多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿歸為一類，多刺綠絨蒿的來源中增加總狀綠絨蒿；五脈綠絨蒿、全緣綠絨蒿、紅花綠絨蒿各分為一類；在實際應用中不可將五脈綠絨蒿、全緣綠絨蒿、紅花綠絨蒿與多刺綠絨蒿混用，注意區分。目前，綠絨蒿種類復雜，基原混亂，其具有極大的種類差異，在品種分類和研究應用方面需要給予更多的關注。本研究從物質基礎角度分析了5個基原綠絨蒿的差異性，差異性成分可考慮作為不同基原綠絨蒿的品種鑒別的參考依據，后續將對5個基原綠絨蒿之間的差異性成分進行詳細分析，也將從藥理和臨床應用方面對這5個基原綠絨蒿的差異作進一步研究。