基于薄層色譜-生物自顯影-MSn法表征枸骨葉中的脂肪酶抑制活性成分

周明哲，馮海燕，吳 弢

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

枸骨IlexcornutaLindl.ex Paxt.系冬青科冬青屬植物，在我國分布廣泛。枸骨的干燥葉為我國傳統(tǒng)中藥枸骨葉，自唐代以來被多部本草專著所收錄，具有上千年的藥用歷史。《中華人民共和國藥典》(2020年版 一部)中記載枸骨葉味苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，具有清熱養(yǎng)陰、益腎、平肝之功，用于肺癆咯血、骨蒸潮熱、頭暈?zāi)垦５萚1]。在民間，因枸骨葉的清熱功效，其嫩葉被作為苦丁茶沖泡飲用。現(xiàn)代研究表明，枸骨葉中含有豐富的三萜及其皂苷，是其主要有效成分，此外還有黃酮、多酚、甾醇等多種成分，具有降血脂、抗心肌缺血、抗氧化、免疫抑制、抗生育[2]等多種活性。由于減肥藥大多療效不顯著，副作用大，枸骨葉的降脂活性逐漸引起人們的關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者已對枸骨葉的化學(xué)成分進(jìn)行了較多研究，但均以傳統(tǒng)的化學(xué)成分分離法尋找枸骨葉的降脂活性成分，存在耗時多、操作復(fù)雜、活性成分丟失等弊端。

薄層色譜-生物自顯影是一種集鑒定、分離和活性測定于一體的藥物篩選技術(shù)，近20年來被廣泛應(yīng)用于抗氧化劑[3]、膽堿酯酶抑制劑[4]以及脂肪酶抑制劑[5]等的快速篩選，同時該方法具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)少等特點(diǎn)。直接離子化技術(shù)是泛指在常壓下，對未經(jīng)預(yù)處理的復(fù)雜基體樣品進(jìn)行快速質(zhì)譜分析的新型離子化技術(shù)。薄層色譜-靜電場誘導(dǎo)噴霧離子化多級質(zhì)譜(TLC-EFISI-MSn)聯(lián)用技術(shù)[6,7]，可實(shí)現(xiàn)枸骨葉薄層生物自顯影圖譜中活性成分的原位結(jié)構(gòu)表征。該直接離子化技術(shù)可在沒有額外氣體和加熱裝置的條件下，使薄層色譜板上的化合物經(jīng)微滴萃取，直接在靜電場作用下實(shí)現(xiàn)離子化[6]，進(jìn)入質(zhì)譜儀分析；是一種拆裝方便、操作簡單、檢測迅速的離子化方法。因此本文采用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)-質(zhì)譜聯(lián)用的方法從枸骨葉快速辨識出具有降脂活性的成分，從而為明確枸骨葉降脂藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

枸骨葉藥材購自亳州中藥材市場，經(jīng)上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定為冬青科植物枸骨IlexcornutaLindl.ex Paxt的干燥葉，其標(biāo)本現(xiàn)保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所標(biāo)本室內(nèi)，標(biāo)本編號為20110113-7。

1.2 儀器

BSA124S-CW、BP211D型電子分析天平(德國Sartorius公司);5800型超聲波清洗機(jī)(300 W，40 kHz，美國Branson公司);Milli-Q Reference超純水機(jī)(德國Merck公司);Automatic TLC Sampler 4全自動薄層色譜點(diǎn)樣儀(瑞士CAMAG公司);TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司);PH400型pH計(上海安萊立思儀器科技有限公司);SC-15超級恒溫槽(上海比朗儀器有限公司);LTQ離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);高壓裝置(上海潤成生物科技有限公司);熔融石英毛細(xì)管(0.15 mm ID，0.22 mm OD，澳大利亞Trajan Scientific and Medical公司)。

1.3 材料、藥品與試劑

高效薄層色譜硅膠板(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所)；肉豆蔻酸-2-萘酯(批號：H6N8O-AD，日本Tokyo Chemical Industry公司)；豬胰脂肪酶(批號：SLCD5418，美國Sigma-Aldrich公司)；固藍(lán)B鹽(批號：M25J10L90478，上海源葉生物科技有限公司)；對照品地榆皂苷I(ziyuglycoside I，批號：Z17D6X5578，純度≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司)、地榆皂苷II(ziyuglycoside II)、冬青苷I(iiexside I)、冬青苷II(iiexside II)、枸骨皂苷A～F(ilexcornutosides A-F)、毛冬青素Q(ilexpublesnin Q)、3β-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-19α-羥基熊果-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(3β-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyl]-19α-hydroxyurs-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester)為實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥ 95%；三-(羥甲基)-氨基甲烷、95%乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、98%甲酸、硫酸、石油醚、鹽酸、無水氯化鈣、二甲基硅油、正己烷等，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1 溶液的配制

Tris-HCl-CaCl2(50 mmol/L，pH 7.3)緩沖液[5]：稱取適量三-(羥甲基)-氨基甲烷和無水氯化鈣適量，用超純水溶解，再加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7.3，配制成50 mmol/L的Tris-HCl-CaCl2緩沖液(pH7.3)。

脂肪酶(60 U/mL)溶液[5]：稱取適量豬胰脂肪酶，加入Tris-HCl-CaCl2(50 mmol/L，pH7.3)緩沖液溶解，配制成60 U/mL的脂肪酶溶液，于0～4 ℃下避光保存?zhèn)溆茫R用前配制。

肉豆蔻酸-2-萘酯(4.0 mmol/L)溶液[5]：稱取適量肉豆蔻酸-2-萘酯，加入石油醚溶解，配制成4.0 mmol/L的肉豆蔻酸-2-萘酯溶液，作為底物，于0～4 ℃下避光保存?zhèn)溆茫R用前配制。

固藍(lán)B鹽(1 mg/mL)溶液[5]：稱取適量固藍(lán)B鹽，加入超純水溶解，配制成1 mg/mL固藍(lán)B鹽溶液，作為顯色劑，于0～4 ℃下避光保存?zhèn)溆茫R用前配制。

供試品溶液：取枸骨葉粉末2 g，加入70%乙醇水溶液40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，加二氯甲烷40 mL振搖提取，棄去二氯甲烷液，水層加濃氨試液2 mL，搖勻，再加水飽和的正丁醇40 mL振搖提取，分取正丁醇液，濃縮至干，殘渣加甲醇2 mL使溶解。

對照品溶液：取地榆皂苷I、地榆皂苷II、冬青苷I、冬青苷II、枸骨皂苷A～F、毛冬青素Q適量，分別加甲醇溶解制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。取3β-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-19α-羥基熊果-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷適量，加50%甲醇水溶解制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。

顯色劑溶液[8]：取適量硫酸，加入乙醇稀釋成10%硫酸乙醇溶液。

1.4.2 活性斑點(diǎn)的標(biāo)記

取“1.4.1”中供試品溶液，點(diǎn)樣于兩張薄層色譜硅膠板上，每張色譜板上點(diǎn)三個條帶，條帶寬度均為8 mm，點(diǎn)樣量均為10 μL。兩張色譜板分別以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶0.3，V/V/V/V)、乙酸乙酯-甲醇-水(6∶2∶1，V/V/V)展開，取出，晾干。每張色譜板再分成三塊，一塊噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[1]，于可見光下檢視；一塊用于薄層色譜-生物自顯影分析[5]，于可見光下檢視并篩選具有脂肪酶抑制活性的斑點(diǎn)，標(biāo)記各斑點(diǎn)所在位置并計算Rf值；另一塊用于質(zhì)譜檢測，即根據(jù)活性斑點(diǎn)的Rf值，在板上相同位置作標(biāo)記，標(biāo)記的斑點(diǎn)用于質(zhì)譜檢測。

1.4.3 EFISI-MSn方法

待測板在室溫下用二甲基硅油-正己烷(1∶1，V/V)浸潤30 min，再以甲醇-水(1∶1，V/V)或甲醇-水(7∶3，V/V)為提取劑依次提取薄層板上的待測成分，待測成分在靜電場作用下經(jīng)毛細(xì)管進(jìn)入質(zhì)譜，毛細(xì)管末端到質(zhì)譜入口約為2 mm，裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。正離子模式下，誘導(dǎo)電壓(induced voltage)為4 000 V；毛細(xì)管電壓(capillary voltage)為40 V；透鏡電壓(tube lens voltage)為100～250 V；毛細(xì)管溫度(capillary temperature)為300 ℃；全掃描范圍為m/z100～1 500。采用碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation)的多級質(zhì)譜碎裂模式，歸一化碰撞能量(normalized collision energy)為15～20 eV[6,7]。裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 TLC-EFISI-MS裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of TLC-EFISI-MS device

1.4.4 結(jié)果驗(yàn)證

取“1.4.1”中枸骨葉供試品溶液和各對照品溶液，點(diǎn)于同一薄層色譜硅膠板上，點(diǎn)樣量均為5 μL，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶0.3，V/V/V/V)為展開劑展開，進(jìn)行薄層鑒別[1]。另取同樣的供試品溶液和各對照品溶液，按照上述方法點(diǎn)樣，展開，用于薄層色譜-脂肪酶抑制生物自顯影分析[5]，并于可見光下檢視。

2 結(jié)果與討論

2.1 枸骨葉中具有脂肪酶抑制活性成分的篩選

按“1.4.2”中方法，分別以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶0.3，V/V/V/V)、乙酸乙酯-甲醇-水(6∶2∶1，V/V/V)展開后的兩張色譜板，每張色譜板再分成三塊，一塊用于10%硫酸乙醇試劑顯色；一塊用于薄層色譜-脂肪酶抑制生物自顯影分析，篩選得到10個活性斑點(diǎn)(spot 1-10)；比較圖2A和2B可知，10%硫酸乙醇試劑顯色的色譜板中，10個活性斑點(diǎn)呈現(xiàn)棕紅色，推測這10個化合物可能為三萜類；另一塊根據(jù)活性斑點(diǎn)的Rf值，在板上相同位置做標(biāo)記(見圖2C)，并依次進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

圖2 枸骨葉中脂肪酶抑制活性化學(xué)成分TLC色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of components with lipase inhibitory activity in Ilicis Cornutae Folium注：I.三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶0.3，V/V/V/V)；II.乙酸乙酯-甲醇-水(6∶2∶1，V/V/V)。A.噴以10%硫酸乙醇試劑顯色，可見光下檢視；B.薄層色譜-脂肪酶抑制生物自顯影檢視；C.擬用于質(zhì)譜檢測的薄層色譜板。Note:I.Trichloromethane-Ethyl acetate-Methanol-Water (1∶3∶1∶0.3,V/V/V/V);II.Ethyl acetate-Methanol-Water (6∶2∶1,V/V/V).A.Sprayed by 10% H2SO4 ethanol solution as the derivatization reagent,observed under sun-light;B.Thin layer chromatography-bioautogram with lipase inhibition;C.TLC with marked spots for mass spectrometry detection.

2.2 質(zhì)譜檢測與分析

對圖2中標(biāo)注的各斑點(diǎn)進(jìn)行TLC-EFISI-MSn分析[7]，結(jié)果如下：

斑點(diǎn)1～4和6在正離子模式下，出現(xiàn)[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰；斑點(diǎn)5、7～10在正離子模式下出現(xiàn)[M+2Na-H]+的準(zhǔn)分子離子峰。通過多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)報道[9-12]，對各斑點(diǎn)所含成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1。

表1 枸骨葉薄層生物自顯影色譜中脂肪酶抑制活性斑點(diǎn)的TLC-EFISI-MSn鑒定結(jié)果Table 1 TLC-EFISI-MSn characterization of active spots in TLC bioautogram of Ilicis Cornutae Folium

續(xù)表1(Continued Tab.1)

由結(jié)果可知，表征出的結(jié)構(gòu)均為三萜皂苷類成分，且多為五環(huán)三萜，區(qū)別在于C-3和C-28上取代糖鏈的不同。其中糖鏈上不帶有酸性基團(tuán)的成分(斑點(diǎn)1～4和6)在MS分析中均出現(xiàn)[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰，而糖鏈上帶有羧基(-COOH)或磺酸基(-SO3H)的成分(斑點(diǎn)5、7～10)則出現(xiàn)了雙Na加合物的[M+2Na-H]+準(zhǔn)分子離子峰。這種獨(dú)特的加合離子已在某些三萜[13,14]、甾體[15]、氨基酸[16]等類成分的質(zhì)譜加合離子中被檢測到，這可能是在正離子模式下，羧酸基團(tuán)的脫質(zhì)子化導(dǎo)致含有多個Na離子的加合離子的形成[15]，說明質(zhì)譜產(chǎn)生加合離子的種類高度依賴于化合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而不依賴于其骨架[7]。

選取裂解方式具有代表性的斑點(diǎn)2和3，簡要介紹其結(jié)構(gòu)鑒定過程。正離子模式下，斑點(diǎn)2和3顯示出相似的裂解行為，一級質(zhì)譜中均出現(xiàn)m/z789[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰，可知斑點(diǎn)2和3互為同分異構(gòu)體。在二級質(zhì)譜中，斑點(diǎn)2和3均產(chǎn)生一六碳糖基162 amu丟失后的碎片離子m/z627，斑點(diǎn)3還產(chǎn)生了44 amu丟失后的碎片離子m/z745和碎片離子m/z335。由文獻(xiàn)可知，枸骨葉中三萜皂苷類成分的糖基主要連接在C-3和C-28上，且五碳糖多為阿拉伯糖基，六碳糖主要為葡萄糖基[2]；此外，C-3與C-28上均連有糖鏈的三萜皂苷，C-28位連接的糖鏈優(yōu)先斷裂[17-19]，這可能是由于C-28位的酯鍵較C-3位的醚鍵更易斷裂[20]，說明斑點(diǎn)2的C-28上連有一葡萄糖基；斑點(diǎn)3的C-28為一羧基。在斑點(diǎn)2和3失去一六碳糖后的三級質(zhì)譜分析中，均出現(xiàn)m/z583、495、477的離子峰，即分別發(fā)生了44、132、150 amu的丟失，可知斑點(diǎn)2的C-3上連有一五碳糖基，推測為阿拉伯糖基，斑點(diǎn)3的一級電離中出現(xiàn)碎片離子m/z335，系為一阿拉伯糖基和一葡萄糖基組成的二糖殘基，因此推斷C-3上連接的是一個五碳糖(阿拉伯糖)基和一六碳糖(葡萄糖)基組成的二糖鏈。通過以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)報道[9]，推測斑點(diǎn)2為地榆皂苷I(ziyuglycoside I)，斑點(diǎn)3除包含母核為坡模酸型的冬青苷I(iiexside I)之外，可能還存在冬青苷I的同分異構(gòu)體枸骨皂苷E(iiexcornutoside E)，其裂解方式與冬青苷I相同，因此推斷斑點(diǎn)3中可能包含2個化合物。斑點(diǎn)2、3的多級質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 斑點(diǎn)2和3的TLC-MS1-4質(zhì)譜圖Fig.3 TLC-MS1-4 spectra of spots 2 and 3

2.3 枸骨葉中具有脂肪酶抑制活性成分的驗(yàn)證與討論

由圖4可知，地榆皂苷II、地榆皂苷I、毛冬青素Q、冬青苷II、3β-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-19α-羥基熊果-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷分別與活性斑點(diǎn)1、2、5、6、10的Rf值一致。此外，冬青苷I與枸骨皂苷E互為同分異構(gòu)體，區(qū)別為冬青苷I為熊果烷型三萜，枸骨皂苷E為齊墩果烷型三萜，二者裂解方式相同，且與活性斑點(diǎn)3的Rf值一致；斑點(diǎn)3可能包含2個化合物，即冬青苷I和枸骨皂苷E；枸骨皂苷A～D和枸骨皂苷F均為18,19-裂環(huán)型三萜皂苷，且與活性斑點(diǎn)4的Rf值一致，其中枸骨皂苷A～C和枸骨皂苷F互為非對映異構(gòu)體，因此斑點(diǎn)4則可能為包含5個化合物枸骨皂苷A～D和枸骨皂苷F的混合斑點(diǎn)。斑點(diǎn)1為地榆皂苷II；斑點(diǎn)2為地榆皂苷I；斑點(diǎn)5為毛冬青素Q；斑點(diǎn)6為冬青苷II；斑點(diǎn)10為3β-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-19α-羥基熊果-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，即共有12個化合物經(jīng)與對照品比對得到驗(yàn)證。

同時，由圖4所示的薄層色譜及薄層色譜-生物自顯影檢視結(jié)果可知，斑點(diǎn)2、3、4、6較為明顯，提示上述斑點(diǎn)所包含的成分在枸骨葉中的含量較高，可能是該藥材發(fā)揮降脂減肥功效的主要成分。

圖4 枸骨葉具有脂肪酶抑制活性成分的薄層色譜及薄層色譜-生物自顯影驗(yàn)證Fig.4 Verification of components with lipase inhibitory activity in Ilicis Cornutae Folium by TLC and TLC bioautography with lipase inhibition注：A.噴以10%硫酸乙醇試劑顯色，可見光下檢視；B.薄層色譜-脂肪酶抑制生物自顯影檢視。1.地榆皂苷II；2.地榆皂苷I；3.冬青苷I；4.枸骨皂苷E；5.枸骨皂苷C；6.枸骨皂苷B；7.枸骨皂苷F；8.枸骨皂苷A；9.枸骨皂苷D；10.毛冬青素Q；11.冬青苷II；12.3β-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-19α-羥基熊果-12-烯-28-酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷；13.枸骨葉供試品。Note:A.Sprayed by 10% H2SO4 ethanol solution as the derivatization reagent,observed under sun-light;B.Thin layer chromatography-bioautograam with lipase inhibition.1.Ziyuglycoside II;2.Ziyuglycoside I;3.Ilexside I;4.Ilexcornutoside E;5.Ilexcornutoside C;6.Ilexcornutoside B;7.Ilexcornutoside F;8.Ilexcornutoside A;9.Ilexcornutoside D;10.Ilexpublesnin Q;11.Ilexside II;12.3β-O-[α-L-Arabinopyraosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyl]-19α-hydroxyurs-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester;13.Ilicis Cornutae Folium test sample.

3 結(jié)論

本文首先將枸骨葉供試品在三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶0.3，V/V/V/V)和乙酸乙酯-甲醇-水(6∶2∶1，V/V/V)兩個系統(tǒng)下展開以獲得更多斑點(diǎn)，通過薄層色譜-脂肪酶抑制生物自顯影檢視，篩選出枸骨葉中具有脂肪酶抑制活性的10個斑點(diǎn)，再以TLC-EFISI-MSn技術(shù)對上述斑點(diǎn)進(jìn)行快速結(jié)構(gòu)解析。由多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報道，推測不同化合物可能的裂解途徑，并初步表征出15個可能的結(jié)構(gòu)，均為三萜皂苷類成分，包括9個熊果烷型三萜，1個齊墩果烷型三萜，和5個18,19-裂環(huán)型三萜。經(jīng)與對照品比對，其中12個化合物得到驗(yàn)證。該方法能夠快速從枸骨葉中篩選、表征出具有脂肪酶抑制活性成分，從而為明確枸骨葉降脂藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。