響應面法優化栽培川貝母熱風干燥工藝

種葉敏，李 巧，楊轉珍，楊永泓，蔣孟蓮，蔡曉洋，李 敏*，黃 勇

1成都中醫藥大學藥學院/現代中藥產業學院 省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137；2四川綠林川貝母種植有限公司，涼山彝族自治州 615000

川貝母FritillariacirrhosaD.Don為中藥材川貝母的基原之一，又稱為卷葉貝母，收載于《中華人民共和國藥典》2 020年版(后簡稱《中國藥典》)，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結消癰的功效[1]。目前川貝母藥材的加工方式仍較為傳統，不適用于栽培川貝母的產業化發展。課題組前期對比了傳統曬干與3種現代干燥方法在外觀性狀及內在質量的利弊，發現熱風干燥方法可廣泛應用于栽培川貝母的產地加工[2]，此法可較好保持藥材的外觀性狀，減少有效成分損失，可為栽培川貝母規模化生產節約時間成本，但同時觀察到熱風干燥所得藥材外觀性狀易受溫度變化的影響，因此有待進一步對熱風干燥工藝進行優化。

目前川貝母藥材尚未形成統一、科學的產地加工規范，盲目、隨意的干燥過程會導致川貝母藥材質量不一，分段式變溫干燥可縮短干燥時間、提高干燥速率、改善干燥品質，已應用于如西洋參[3]、太子參[4]等中藥材[5]及食品[6-11]產業中。課題組前期實驗發現間歇二段式干燥所得藥材表面顏色較白，皺縮程度及粗糙感較輕，外觀性狀相比恒溫干燥得到較大改善。因此本文對栽培川貝母熱風干燥進一步進行工藝優化，以響應面法設計優選最佳分段式熱風干燥工藝，同時比較恒溫干燥與分段式變溫干燥對栽培川貝母藥材的影響，以期為其規范化產地加工提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品為4～5年生的栽培卷葉貝母，采挖自四川綠林川貝母種植有限公司生產基地，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為百合科川貝母FritillariacirrhosaD.Don的鱗莖(標本號：LV5134332105200002LY)。挑選無腐爛損傷、直徑1.0～1.5 cm的鮮鱗莖作為試驗樣品。

1.2 儀器與試劑

Nikon SMZ745體視顯微鏡(尼康公司)；CR-400色彩色差計(日本美能達公司)；A580紫外可見光光度計(上海翱藝儀器有限公司)；HY-4A數顯調速多用振蕩器(金壇市城東新瑞儀器廠)；BC0 705淀粉含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；Ultimate 3 000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

三氯甲烷、溴甲酚綠、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉為分析純；對照品西貝母堿(批號wkq19 051 302，純度≥98%)、腺苷(批號110 879-201 703，純度≥99.7%)、肌苷(批號140 669-201 606，純度≥98.6%)均購自中國食品藥品檢定院；腺嘌呤(批號wkq21 060 210，純度≥98%)、尿苷(批號wkq21 081 905，純度≥98%)、鳥苷(批號wkq21 042 810，純度≥98%)、尿嘧啶(批號wkq21 101 205，純度≥98%)、胸腺嘧啶(批號wkq20 121 703，純度≥98%)、2′-脫氧腺苷(批號wkq21 031 909，純度≥98%)、胞苷(批號wkq19 011 101，純度≥98%)，次黃嘌呤(wkq21 060 210，純度≥98%)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；胸苷(BCBSZ979V，純度≥99%)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；甲醇為色譜純，水為超純水。

1.3 單因素實驗

水分轉換點考察：對于二段式干燥，水分轉換點是干燥過程中的關鍵，同時在課題組前期實驗發現50 ℃熱風干燥在一定程度上雖加快了干燥速率，但是與自然曬干比較，性狀上仍有一定差異，藥材表面顏色略黃，斷面粉性略差，不同方法對藥材性狀至關重要，所以此實驗以性狀作為評價指標考察其水分轉換點。

經預實驗測得卷葉貝母鮮鱗莖含水量為70%，取新鮮鱗莖，分別在50 ℃干燥至含水量為30%、40%、50%、60%(見圖1A～1D)后，取出放置12 h，再繼續干燥至安全水分。

圖1 不同水分轉換點藥材圖Fig.1 Diagram of medicinal materials at different moisture transition points

不同水分轉換點藥材外觀性狀見圖1，由結果可知，當轉換水分含量越高時，其干燥后藥材性狀越差，這與傳統日曬中干燥至表皮出現粉白色即可翻動有關。說明干燥過程的含水量變化對其外觀性狀至關重要，其中含水量為60%時藥材性狀最差，故選用含水量為30%～50%作為后期工藝篩選因素。

1.4 響應面曲線篩選工藝

1.4.1 熱風干燥實驗方法

以第一階段溫度(X1)、水分轉換點(X2)、第二階段溫度(X3)為參數，設計篩選工藝表(見表1)。在進行干燥試驗時，每隔1 h對卷葉貝母藥材進行稱重，依次記錄卷葉貝母的重量變化情況，直到干燥，迅速取出放在干燥器中冷卻，然后進行下一組試驗。每組試驗重復3次。

表1 分段式干燥參數設定Table 1 Setting parameters of stage-changed drying

1.4.2 驗證實驗

取卷葉貝母新鮮鱗莖，以“1.4.1”篩選得出的最佳二段式熱風干燥工藝制備3批藥材，測定藥材外觀性狀及內在質量，計算歸一值(normalized value,OD值)。

1.4.3 恒溫干燥與二段式干燥藥材品質比較

取新鮮卷葉貝母鱗莖，分別設置60、50、40 ℃恒溫干燥與二段式干燥處理，設置鼓風風速0.15 m/s，熱風干燥，分別每隔1 h取樣一次進行稱重，繪制干燥曲線，即含水量(MR)隨時間(T)的變化曲線，并對恒溫干燥與二段式干燥所得藥材進行外觀性狀與內在質量品質評價。

式中，Mt指時刻含水量，Mo指初始含水量，Me指平衡狀態下含水量。

1.5 藥材性狀測定

按照課題組前期實驗方法[2]，對所得藥材表面、斷面分別評分，兩者之和為藥材性狀得分。

1.6 總淀粉含量測定

根據課題組前期實驗方法[2]對不同處理下栽培卷葉貝母藥材總淀粉含量進行測定。

1.7 總生物堿含量測定

參照《中國藥典》2020年版第一部川貝母項下紫外-可見分光光度法測定。

1.8 總核苷含量測定

1.8.1 供試品溶液的制備

精確稱取栽培卷葉貝母粉末0.5 g，分別精密加入水5 mL，稱定重量，超聲45 min，取出冷卻，補足重量，搖勻，取部分供試液于離心管中，8 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.8.2 混合對照品溶液的制備

精確稱取尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷適量于10 mL容量瓶，以水溶解并定容，即為各核苷類成分的對照品儲備液。再取各核苷類儲備液適量，置于10 mL容量瓶中，以水稀釋并定容至刻度線，即混合對照品溶液。

1.8.3 色譜條件

色譜柱為Insertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫，洗脫程序為：0～4.0 min，1.0% A；4.0～4.1 min，1.0%→5.5% A；4.1～12.5 min，5.5%→14.5%A；12.5～18.0 min，14.5%→20.0% A；18～24 min，20.0% A；24～28 min，20.0%→1.0% A；28～30 min，1.0% A；柱溫35 ℃；檢測波長為260 nm；進樣量20 μL；體積流量為0.8 mL/min，樣品與混合對照品溶液色譜圖見圖2。

圖2 樣品溶液(A)與混合對照品溶液(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample solution (A) and mixed reference substance solution (B)注：1.尿嘧啶；2.胞苷；3.次黃嘌呤；4.尿苷；5.胸腺嘧啶；6.肌苷；7.鳥苷；8.腺嘌呤；9.胸苷；10.腺苷；11.2′-脫氧腺苷。Note:1.Uracil;2.Cytidine;3.Hypoxanthine;4.Uridine;5.Thymine;6.Inosine;7.Guanosine;8.Adenine;9.Thymidine;10.Adenosine;11.2′-Deoxyadenosine.

1.8.4 方法學考察

1.8.4.1 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液1 000、500、250、100、50 μL至1 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到5個不同濃度的混合對照品溶液。按“1.8.3”色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到線性回歸方程，同時以信噪比(S/N)大于10為定量限，大于3為檢出限，結果見表2。

表2 線性回歸方程及相關系數Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient

1.8.4.2 精密度考察

取同一藥材粉末，按照“1.8.1”項下方法制備供試品，按照“1.8.3”項下色譜方法進行檢測，連續進樣6次，記錄主要色譜峰的峰面積。結果見表3，可知主要核苷類成分的峰面積RSD范圍為0.57%～2.90%，表明儀器精密度良好。

表3 核苷類成分精密度考察Table 3 Precision investigation of nucleosides

1.8.4.3 重復性考察

精密稱取同一藥材粉末6份，按照“1.8.1”項供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照“1.8.3”項下色譜方法進行檢測，記錄主要色譜峰的峰面積，數據結果見表4，其表明主要核苷類成分的含量RSD范圍為0.70%～3.06%，說明該方法重現性好。

表4 核苷類成分重復性考察Table 4 Repeatability investigation of nucleosides

1.8.4.4 穩定性考察

取同一份藥材粉末，按照“1.8.1”項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h按照“1.8.3”項下方法進行檢測，記錄主要色譜峰的峰面積，其結果見表5，在12 h內，主要核苷類成分的峰面積RSD范圍為0.72%～3.66%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

表5 核苷類成分穩定性考察Table 5 Stability investigation of nucleosides

1.8.4.5 加樣回收率試驗

取已知核苷類成分含量的樣品，分別加入一定量的對照品，測定其含量并計算回收率，11個核苷類成分的平均回收率在91.5%～107.9%之間，RSD≤5.0%，表明回收率良好，具體結果見表6。

表6 加樣回收率測定結果(n = 6)Table 6 Determination results of sample recovery rate (n = 6)

1.8.4.6 耐用性考察

取同一份樣品，按照上述方法制備供試品溶液，分別采用色譜柱1：Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、色譜柱2：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、色譜柱3：Waters HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱按照上述色譜方法進行檢測，結果見表7。結果表明，不同色譜柱所得成分RSD范圍在0.71%～2.95%，說明該方法色譜柱耐用性良好。

表7 譜柱耐用性考察Table 7 Column durability investigation

1.8.5 評價指標

按以上方法測定所得藥材總生物堿、總淀粉及總核苷含量，以Hassan法將各指標進行歸一化處理，以OD值作為評價指標。

1.8.6 數據處理

數據采用Excle 2019進行處理，響應面圖形釆用Design Expert 8.0.6軟件繪制，其余圖形由origin 2022軟件繪制。

2 實驗結果

2.1 響應面曲線篩選工藝

2.1.1 響應面法優化熱風聯合干燥實驗結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件按照Box-Behnken的中心組合實驗設計，選擇3個中心實驗點，得到17個實驗點，進行3因素3水平試驗，具體實驗設計見表8。

表8 分段式干燥實驗設計方案及結果Table 8 Design scheme and results of segmented drying experiment

2.1.2 質量測定結果

17組處理藥材性狀及總生物堿、總淀粉含量測定結果與各指標計算所得OD值見表9，核苷類成分測定結果見表10。

表9 藥材外觀性狀及總生物堿、總淀粉含量Table 9 Appearance properties and total alkaloid and total starch content of medicinal

表10 核苷類成分含量(n = 2)Table 10 Nucleoside content (n = 2)

2.1.3 統計學分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對第一階段溫度、水分轉換點、第二階段溫度進行二項式擬合，得擬合方程為OD=0.872-0.038X1+0.137X2+0.059X3+0.148X1X2+0.027X1X3+0.160X2X3-0.185X12-0.238X22-0.286X32。相關系數R2=0.991 7，模型的P<0.000 1，說明模型高度顯著，可用于栽培川貝母干燥工藝的分析和預測。由表11可知，回歸方程失擬性檢驗P=0.479 5(>0.05)，無顯著性差異，說明該方程與實際情況擬合良好，模型的殘差可能是隨機誤差產生，可用此模型來分析預測最佳分段式干燥工藝條件。

表11 方差分析結果Table 11 ANOVA results

續表11(Continued Tab.11)

根據方差分析結果，影響OD值的工藝參數主次排序為X2>X3>X1，即水分轉換點>第二階段溫度>第一階段溫度，顯著性分析發現X2對OD值的影響達極顯著水平(<0.000 1)，交互作用項X2X3對OD值達到極顯著水平(<0.000 1)。

根據模型分析結果，采用Design Expert 8.0.6軟件繪制任意2個因素對OD值影響的響應面圖，詳見圖3。響應面較為直觀地反映了兩兩因素對響應OD值的影響，等高線說明了兩兩因素間交互作用的顯著，各因素對OD值響應的順序為：水分轉換點、第二階段溫度、第一階段溫度，與方差分析結果相同。

圖3 各因素交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

2.1.4 最優熱風干燥工藝的確定

采用Design Expert 8.0.6軟件對擬合方程進行求解，得到栽培卷葉貝母二段式干燥工藝為：第一階段干燥溫度為60 ℃，干燥至含水量為47.16%，取出放置12 h，于53.5 ℃干燥至含水量≤15.0%，預測OD值為0.767 0。根據實際操作，最終確定最優二段式干燥工藝為第一階段干燥溫度為60 ℃，干燥至含水量為45%，取出放置12 h，于50 ℃干燥至含水量≤15.0%。

2.2 驗證實驗結果

按照響應面曲線設計得到的最優熱風干燥工藝制備3批藥材，得到3批二段式干燥藥材的外觀性狀及內在質量測定結果(見表12、13)，其平均OD值為0.785 5，與預測OD值0.767 0偏差為0.013(RSD為1.58%)，可見，采用響應面優選出的最佳二段式工藝具有可靠性與穩定性。

表12 核苷類成分含量測定結果(n=2)Table 12 Determination results of nucleosides content (n=2)

表13 驗證結果Table 13 Verification results

2.3 二段式干燥與恒溫干燥藥材品質比較

2.3.1 干燥曲線

測定結果見圖4，隨著溫度的升高，干燥時間縮短，到達安全水分時間分別為40、85、140、85 h，其中二段式干燥達到水分轉化點45%耗時約10 h，取出放置時間為12 h，實際干燥時間少于50 ℃恒溫干燥、遠少于40 ℃恒溫干燥。

圖4 干燥曲線Fig.4 Drying curve

2.3.2 外觀性狀

由圖5可見，相較于二段式干燥方法，40～60 ℃恒溫干燥所得藥材性狀較差，且隨著干燥溫度的升高，角質化程度增加形成類似“油子”的性狀，同時鱗葉開裂情況加深，斷面粉性減弱，出現角質化顆粒。這可能是由于貝母富含淀粉，在長時間高溫條件下淀粉易變性糊化引起，同時斷面粉性變差。而40 ℃干燥耗時長，部分藥材表面發生褐變，使得表面顏色偏暗，皺縮明顯。50 ℃雖表面顏色較均勻，角質化程度少，但相較于二段式干燥其開裂程度及表面粗糙感增加。

圖5 藥材性狀比較圖Fig.5 Comparison of medicinal properties注：A.藥材圖；B.表面特征；C.斷面特征。Note：A.Medicinal material diagram;B.Surface features;C.Section features.

2.3.3 內在質量

40、50、60 ℃恒溫干燥與二段式干燥處理得到的藥材總生物堿、總淀粉含量測定結果見圖6，由結果可知，二段式干燥藥材在總生物堿、總淀粉含量上具有一定優勢，遠高于40、60 ℃恒溫干燥藥材(P<0.05)。核苷類成分測定結果見圖7，其結果顯示，二段式干燥所得藥材總核苷含量高于40、60 ℃恒溫處理下藥材，略低于50 ℃恒溫處理，但在尿嘧啶、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷等成分上均具有明顯優勢。

圖6 總生物堿、總淀粉含量Fig.6 Total alkaloid and total starch content注：圖中不同小寫字母代表不同處理組間的差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters in the figure represent significant differences among different treatment groups(P<0.05).

圖7 核苷類成分比較結果Fig.7 Comparison results of nucleosides

3 結論與討論

目前川貝母藥材在市場上以野生品為主，但由于人們過度采挖、自然環境下種子發芽率低、生長條件苛刻等原因，野生資源日益減少，人工栽培興起，與此出現的栽培品形狀變異已成為普遍但目前仍無法解決的問題，優質的外觀性狀及內在品質對川貝母藥材的用處至關重要，亦會影響其經濟價值。同時如果產地加工不當，藥材極易出現糊化、變色等現象，嚴重影響川貝母藥材性狀，導致藥材銷售困難。川貝母藥材內主要含有生物堿、核苷及淀粉類等成分[12-14]，課題組前期實驗發現浸出物含量越高，川貝母藥材性狀越差，因此本實驗并未采用浸出物作為考察指標，而以藥材性狀、淀粉、總生物堿及總核苷含量歸一化處理后對川貝母藥材質量進行綜合評價。

關于貝母類藥材的加工工藝目前已有較多文獻報道[15-18]，有部分研究針對普通烘干法進行優化，如利用紫外烘曬[19]、過熱蒸汽[20]、熱風-微波聯合[21]等干燥技術，采用變溫和聯合干燥的方法，對貝母類藥材的加工工藝進行提升，但這些方法是否適用于川貝母藥材尚無相關研究，同時介入聯合設備亦會增加藥材的生產成本。川貝母的產地加工方法目前仍主要以恒溫烘干為主，但文獻報道[22-25]的烘干溫度、時間各不相同，課題組前期[2]基于此進行實驗研究，實驗結果表明以50 ℃恒溫烘干藥材外觀性狀及內在質量較佳，本文繼續對川貝母藥材熱風干燥進一步進行工藝篩選，以第一階段干燥溫度(X1)，水分轉換點(X2)，第二階段干燥溫度(X3)3個因素，進行3因素3水平響應面實驗，得到二段式干燥最佳工藝為：60 ℃干燥至含水量為45%，取出放置12 h，于50 ℃干燥至含水量≤15.0%。經驗證并與40～60 ℃恒溫干燥藥材對比，二段式干燥所得藥材顏色偏白、質量優，同時降低了栽培川貝母藥材的干燥時間，節省了加工成本，內在成分可較大程度得到保留。

通過響應面法的設計及優化，本研究對栽培卷葉貝母的熱風烘干工藝進行進一步研究，對川貝母藥材加工方法拓展，為其規范化、規模化、標準化生產提供數據支撐。有研究表明不同大小的川貝母烘干時間差異顯著[22]，因此對大、中、小不同規格的川貝母鮮品建立相對應的二段式干燥方法是否可以節省更多的加工成本還有待研究。