高山蓍中的萜類成分及其降糖活性研究

段江婧，薛金鳳，趙晨光，潘 浩，秦月鴿，馮衛(wèi)生，吳 亞*，薛貴民*

1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046

蓍屬(Achillea)是菊科多年生草本植物，截至目前從蓍屬植物中分離得到了多種類型的化學(xué)成分，如萜類、黃酮、生物堿等，其中含量最豐富的是倍半萜類[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蓍屬植物具有抗菌[2]、抗炎[3]、抗感染、鎮(zhèn)靜[4]、降血糖、調(diào)血脂和解痙[5]等作用。

高山蓍為菊科蓍屬植物，又名一支蒿、鋸齒草、蜈蚣蒿等。該植物生命力頑強(qiáng)，適應(yīng)能力較好，它抗低溫、喜溫暖、半蔭，宜肥沃、濕潤(rùn)的土壤，故常棲息于我國(guó)北方地區(qū)的灌木叢、山坡坡面、山谷濕地等處，在我國(guó)華北、東北、江蘇、寧夏、內(nèi)蒙古以及日本、蘇聯(lián)等地區(qū)均有分布。高山蓍用藥的歷史已經(jīng)有一千多年，最早作為上品記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在古代，因其具有治愈疾病的療效被人們視為“神草”和“靈物”[6]。據(jù)2020版《中國(guó)藥典》記載，此藥味苦、酸，性平、溫，歸肺、脾、膀胱經(jīng)。民間百姓常將高山蓍用于治療外傷破損、感冒發(fā)熱、風(fēng)濕和關(guān)節(jié)疼痛等疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，蓍屬植物的提取物具有降血糖和調(diào)血脂的藥理活性[7]，即表明對(duì)于高山蓍中具有降糖活性化合物的研究具有重要意義。我國(guó)高山蓍植物資源豐富，且應(yīng)用越來(lái)越普遍，使得國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)其產(chǎn)生了研究興趣。所以，為進(jìn)一步研究高山蓍的化學(xué)成分和藥理活性，本文對(duì)高山蓍二氯甲烷部位的化學(xué)成分進(jìn)行提取、分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)這些化合物在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2胰島素抵抗(insulin resistance,IR)細(xì)胞模型上進(jìn)行了細(xì)胞耗糖量的活性篩選[8]，以期豐富該中藥的化學(xué)成分并發(fā)現(xiàn)具有良好降糖活性的化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

LC-52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思(北京)科技有限公司)；Bruker AVANCE 500核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker maxis HD型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；SCIEX Qtrap 5500質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Agilent 1260 InfinityⅡLC高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)。

1.1.2 材料

Sephadex LH-20(40～70 μm，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞士)；大孔樹(shù)脂Diaion HP-20(日本三菱化學(xué))；MCI(日本三菱化學(xué)公司)；YMC-Pack ODS-A(40～60 μm，YMC)；預(yù)制硅膠薄層G板(10～40 μm青島海洋化工廠)；分析純和色譜純?cè)噭?天津恒興和天津四友精細(xì)化學(xué)有限公司)；顯色劑：10%濃硫酸乙醇。

2020年5月在云南省昆明市購(gòu)買，由河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為AchilleaalpinaL.全草，標(biāo)本(20200515)放于河南中醫(yī)藥大學(xué)天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室Bs630。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取分離

高山蓍(5.0 kg)用二氯甲烷溶劑冷浸48 h，室溫下超聲提取三次，每次3 h。合并三次提取液，減壓濃縮得到總浸膏52.0 g。將得到的浸膏與聚酰胺按1∶1的比例拌樣裝于MCI色譜柱中，依次用10%、30%、60%、80%、90%、100%甲醇-水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，將洗脫液減壓濃縮，得到的6個(gè)餾分依次命名為AN1、AN2、AN3、AN4、AN5、AN6。將AN3部位過(guò)Sephadex LH-20處理，用甲醇做流動(dòng)相得到6個(gè)餾分(AN3B1、AN3B2、AN3B3、AN3B4、AN3B5、AN3B6)。將組分AN3B3過(guò)ODS色譜柱，用甲醇/水梯度洗脫得到20個(gè)餾分(AN3B3-1～AN3B3-20)。組分AN3B3-18經(jīng)半制備液相以70%甲醇/水等度洗脫制備得化合物8(tR=20 min，20.0 mg)。組分AN3B3-12經(jīng)半制備液相(30%→70%乙腈/水)制備得到化合物9(tR=32 min，4.4 mg)。組分AN3B3-10經(jīng)半制備液相(45%→80%甲醇/水)制備得到化合物13(tR=31 min，3.2 mg)。

將組分AN3B4過(guò)ODS色譜柱，用甲醇/水梯度洗脫得到15個(gè)餾分(AN3B4-1～AN3B4-15)。組分AN3B4-10經(jīng)半制備液相以55%甲醇/水等度洗脫制備得化合物1(tR=34 min，10.3 mg)。組分AN3B4-15以(30%→95%乙腈/水)為流動(dòng)相經(jīng)半制備液相制備得到化合物2(tR=32 min，3.5 mg)、3(tR=34 min，4.6 mg)、4(tR=40 min，3.5 mg)和7(tR=31 min，6.1 mg)。組分AN3B4-11經(jīng)半制備液相(20%→65%乙腈/水，0→50 min)制備得到化合物5(tR=38 min，5.6 mg)。組分AN3B4-12(35%→80%乙腈/水，0→50 min)制備得化合物6(tR=28 min，2.1 mg)。組分AN3B4-6以(10%→50%乙腈/水，0→50 min)為流動(dòng)相經(jīng)半制備液相制備得到化合物10(tR=24 min，21.0 mg)和11(tR=33 min，3.3 mg)。組分AN3B4-8經(jīng)半制備液相以(10%→70%乙腈/水)洗脫制備得化合物12(tR=30 min，1.4 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒性測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以8 × 103個(gè)細(xì)胞/孔加入96孔板，將板放入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2，孵育24 h，棄去96孔板中培養(yǎng)基，在平板中加入配制好的待測(cè)藥物(最終濃度為50 μmol/L)、空白組(只含DMEM培養(yǎng)基)、對(duì)照組(含有細(xì)胞的培養(yǎng)液)，每個(gè)待測(cè)藥物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入完全培養(yǎng)基為100 μL，孵育48 h。然后再各加入10 μL CCK-8溶液，將平板放入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度，按如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=

1.2.3 化合物降糖活性篩選

用胎牛血清和高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，接種于96板中(4×103個(gè)/孔)，37 ℃培養(yǎng)12 h后棄去上清液，分別加入含有不同濃度的棕櫚酸(PA，0、1、10、100、200、250、350 μmol/L)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。確定對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)損傷作用的棕櫚酸濃度以便進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，鋪入24孔板，培養(yǎng)12 h后，換入上一步實(shí)驗(yàn)得出的非損傷性濃度的棕櫚酸溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)24 h后收取細(xì)胞上清，利用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其中的葡萄糖含量；收取上清后換入含1×10-7mol/L胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后以同法檢測(cè)其中的葡萄糖含量，以使上清葡萄糖含量顯著升高作為確定誘導(dǎo)濃度。最后根據(jù)本部分實(shí)驗(yàn)設(shè)定在PA 200 μmol/L處理建立慢性炎癥HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分組：空白組(只含DMEM培養(yǎng)基)、對(duì)照組(CON，含細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基)、PA模型組(含PA)、陽(yáng)性組羅格列酮(ROSI)和不同化合物干預(yù)PA組。每組設(shè)6復(fù)孔，各組做相應(yīng)處理后于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用葡萄糖臨床試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中的葡萄糖含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)化合物對(duì)HepG2各組細(xì)胞葡萄糖攝取的影響，按如下公式計(jì)算葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗量=空白組葡萄糖含量-實(shí)驗(yàn)組每孔剩余葡萄糖含量

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z403 [M + Na]+，分子式C20H28O7；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.18(1H，m，H-3′)，5.92(1H，d，J=6.0 Hz，H-2)，5.89(1H，d，J=6.0 Hz，H-3)，5.24(1H，m，H-8)，4.30(1H，m，H-6)，2.75(1H，d，J=11.0 Hz，H-5)，2.38(1H，m，H-11)，2.30(1H，m，H-7)，2.24(1H，m，H-9a)，2.03(3H，dd，J=7.0，1.5 Hz，H-4′)，1.93(3H，m，H-5′)，1.80(1H，m，H-9b)，1.45(3H，s，H-15)，1.28(3H，d，J=7.0 Hz，H-13)，1.14(3H，s，H-14))；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：91.4(C-1)，134.3(C-2)，140.8(C-3)，83.1(C-4)，52.3(C-5)，76.3(C-6)，43.0(C-7)，66.2(C-8)，41.0(C-9)，79.3(C-10)，32.3(C-11)，177.6(C-12)，12.9(C-13)，23.2(C-14)，24.2(C-15)，167.0(C-1′)，126.9(C-2′)，140.8(C-3′)，16.1(C-4′)，20.8(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為[3S-[3α,3aα,4α(Z),6α,6aα,9α,9aα,9bβ]],2-butenoic acid,2-methyl-2,3,3a,4,5,6,6a,9,9a,9b-decahydro-6,6a,9-trihydroxy-3,6,9-trimethyl-2-oxoazuleno[4,5-b]furan-4-yl ester。

化合物2無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z259 [M + Na]+，分子式C15H24O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.36(1H，s，H-14)，6.59(1H，m，H-6)，3.48(1H，dd，J=11.5，4.0 Hz，H-10)，2.97(1H，dd，J=15.0，6.0 Hz，H-8a)，2.24(1H，dd，J=10.0，5.0 Hz，H-5)，2.03(1H，m，H-4)，1.92(1H，m，H-8b)，1.86(1H，m，H-3a)，1.78(1H，m，H-9a)，1.62(1H，m，H-11)，1.50(1H，m，H-3b)，1.49(1H，m，H-2a)，1.25(1H，m，H-2b)，1.25(1H，m，H-9b)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，H-12)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-13)，0.73(3H，s，H-15)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：49.5(C-1)，39.6(C-2)，25.0(C-3)，51.0(C-4)，50.4(C-5)，159.6(C-6)，143.6(C-7)，19.6(C-8)，29.0(C-9)，83.4(C-10)，32.3(C-11)，19.5(C-12)，21.6(C-13)，193.2(C-14)，13.5(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為10β-hydroxyisodauc-6-en-14-al。

化合物3無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z261 [M + Na]+，分子式C15H26O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.51(1H，d，J=4.5 Hz，H-6)，4.02(2H，s，H-14)，3.48(1H，dd，J=11.5，4.0 Hz，H-10)，2.82(1H，m，H-8a)，2.54(1H，m，H-9a)，2.42(1H，m，H-11)，2.28(1H，m，H-4)，2.28(1H，m，H-5)，2.07(1H，m，H-8b)，1.80(1H，m，H-9b)，1.50(1H，m，H-2a)，1.50(1H，m，H-3a)，1.35(1H，m，H-2b)，1.35(1H，m，H-3b)，1.26(3H，s，H-15)，0.91(3H，t，J=7.0 Hz，H-12)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：47.9(C-1)，38.5(C-2)，26.7(C-3)，46.8(C-4)，44.3(C-5)，126.6(C-6)，138.8(C-7)，25.3(C-8)，28.8(C-9)，83.2(C-10)，28.9(C-11)，23.4(C-12)，19.7(C-13)，67.7(C-14)，13.6(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物3為isodauc-6-ene-10β,14-diol。

化合物4無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z259 [M + Na]+，分子式C15H24O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.36(1H，s，H-14)，6.64(1H，m，H-6)，3.48(1H，dd，J=11.5，4.0 Hz，H-10)，2.80(1H，m，H-8a)，2.73(1H，m，H-8b)，2.53(1H，m，H-9a)，2.51(1H，m，H-9b)，2.46(1H，m，H-5)，2.22(1H，m，H-4)，1.85(1H，m，H-2a)，1.85(1H，m，H-3a)，1.66(1H，m，H-11)，1.43(1H，m，H-2b)，1.43(1H，m，H-3b)，1.35(3H，s，H-15)，0.94(3H，d，J=7.0 Hz，H-12)，0.94(3H，d，J=7.0 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：48.8(C-1)，39.0(C-2)，24.5(C-3)，49.7(C-4)，49.2(C-5)，159.3(C-6)，143.2(C-7)，19.0(C-8)，28.5(C-9)，82.8(C-10)，31.9(C-11)，19.0(C-12)，21.2(C-13)，192.8(C-14)，13.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物4為aphanamol II。

化合物5無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z261 [M + Na]+，分子式C15H26O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.02(1H，s，H-15a)，4.74(1H，s，H-15b)，3.71(1H，t，J=10.0 Hz，H-6)，3.42(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz，H-1)，2.33(1H，ddd，J=13.0，5.0，2.0 Hz，H-3a)，2.24(1H，m，H-11)，2.07(1H，td，J=13.5，5.0 Hz，H-3b)，1.91(1H，m，H-9a)，1.86(1H，m，H-2a)，1.75(1H，d，J=10.0 Hz，H-5)，1.55(1H，m，H-2b)，1.52(1H，m，H-8a)，1.30(1H，m，H-7)，1.23(1H，m，H-8b)，1.16(1H，m，H-9b)，0.95(3H，d，J=7.0 Hz，H-12)，0.87(3H，d，J=7.0 Hz，H-13)，0.70(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.3(C-1)，32.1(C-2)，35.2(C-3)，146.4(C-4)，56.0(C-5)，67.1(C-6)，49.5(C-7)，18.3(C-8)，36.4(C-9)，41.8(C-10)，26.1(C-11)，21.2(C-12)，16.3(C-13)，11.7(C-14)，108.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定化合物5為ent-4(15)-eudesmene-1β,6α-diol。

化合物6無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z257 [M + Na]+，分子式C15H22O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.13(1H，s，H-12a)，5.01(1H，s，H-12b)，4.18(2H，s，H-13)，2.80(1H，m，H-6a)，2.53(1H，m，H-2a)，2.40(1H，m，H-7)，2.13(1H，m，H-2b)，2.09(1H，m，H-6b)，1.82(1H，m，H-8a)，1.77(3H，d，J=1.0 Hz，H-15)，1.73(1H，m，H-1)，1.73(1H，m，H-8b)，1.67(1H，m，H-9a)，1.44(1H，m，H-1)，1.44(1H，m，H-9b)，1.24(3H，s，H-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為12-羥基-α-香附酮。

化合物7無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z257 [M + Na]+，分子式C15H22O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.79(2H，m，H-12)，3.83(1H，d，J=12.5 Hz，H-1)，2.80(1H，dt，J=14.5，2.5 Hz，H-6a)，2.65(1H，dd，J=16.5，5.0 Hz，H-2a)，2.57(1H，dd，J=16.5，12.5 Hz，H-2b)，2.16(1H，m，H-9a)，2.10(1H，m，H-6b)，2.02(1H，m，H-7)，1.79(3H，s，H-13)，1.78(3H，s，H-15)，1.75(1H，m，H-8a),1.58(1H，m，H-8b)，1.36(1H，m，H-9b)，1.18(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：74.7(C-1)，42.6(C-2)，197.3(C-3)，129.8(C-4)，161.6(C-5)，33.0(C-6)，45.2(C-7)，26.7(C-8)，37.9(C-9)，41.4(C-10)，149.1(C-11)，109.6(C-12)，20.8(C-13)，16.4(C-14)，11.1(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為lβ-羥基-α-香附酮。

化合物8無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z261 [M + Na]+，分子式C15H26O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.94(1H，dd，J=17.0，10.5 Hz，H-2)，5.38(1H，dd，J=17.0，1.5 Hz，H-1a)，5.20(1H，dd，J=8.5，1.0 Hz，H-6)，5.18(1H，dd，J=10.5，1.5 Hz，H-1b)，5.07(1H，ddd，J=7.0，5.5，1.5 Hz，H-10)，4.63(1H，m，H-5)，2.07(2H，m，H-8)，1.98(2H，m，H-9)，1.83(1H，dd，J=14.5，11.0 Hz，H-4a)，1.68(3H，s，H-14)，1.63(3H，s，H-13)，1.59(3H，s，H-12)，1.53(1H，dd，J=14.5，2.0 Hz，H-4b)，1.23(3H，s，H-15)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：112.7(C-1)，144.2(C-2)，74.1(C-3)，47.1(C-4)，67.4(C-5)，127.6(C-6)，138.1(C-7)，39.5(C-8)，26.5(C-9)，123.9(C-10)，131.9(C-11)，25.8(C-12)，17.8(C-13)，16.7(C-14)，30.2(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物8為(E)-3,7,11-trimethyl-1,6,10-dodecatriene-3,5-diol。

化合物9無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z277 [M + Na]+，分子式C15H26O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.94(1H，dd，J=17.0，10.5 Hz，H-2)，5.57(1H，dd，J=14.5，7.5 Hz，H-9)，5.56(1H，d，J=16.0 Hz，H-10)，5.38(1H，dd，J=17.0，1.5 Hz，H-1a)，5.22(1H，dd，J=8.5，1.0 Hz，H-6)，5.17(1H，dd，J=10.5，1.5 Hz，H-1b)，4.63(1H，m，H-5)，2.67(2H，d，J=6.5 Hz，H-8)，1.84(1H，dd，J=15.0，11.0 Hz，H-4a)，1.62(3H，d，J=1.0 Hz，H-14)，1.53(1H，dd，J=15.0，2.0 Hz，H-4b)，1.31(3H，s，H-12)，1.31(3H，s，H-15)，1.28(3H，s，H-13)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：112.8(C-1)，114.0(C-2)，74.2(C-3)，47.0(C-4)，67.3(C-5)，128.3(C-6)，136.7(C-7)，42.2(C-8)，124.4(C-9)，140.2(C-10)，70.8(C-11)，30.3(C-12)，30.3(C-13)，16.7(C-14)，30.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物9為2,6,10-trimethyl-3,6,11-dodecatriene-2,8,10-triol。

化合物10無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z197 [M + H]+，分子式C11H16O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H，s，H-10)，4.32(1H，m，H-5)，2.46(1H，m，H-6a)，1.98(1H，m，H-6b)，1.78(1H，m，H-4a)，1.78(3H，s，H-7)，1.52(1H，m，H-4b)，1.46(3H，s，H-1)，1.27(3H，s，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：26.6(C-1)，27.1(C-2)，36.1(C-3)，45.7(C-4)，66.9(C-5)，47.4(C-6)，36.1(C-7)，86.9(C-8)，172.1(C-9)，113.0(C-10)，182.7(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定化合物10為黑麥草內(nèi)酯。

化合物11無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z169 [M + H]+，分子式C10H16O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.44(1H，s，H-7)，6.83(1H，m，H-2)，2.51(2H，m，H-6)，2.17(2H，m，H-3)，2.05(2H，m，H-5)，1.62(1H，m，H-4)，1.21(3H，s，H-9)，1.21(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：141.6(C-1)，151.2(C-2)，28.2(C-3)，44.9(C-4)，22.3(C-5)，22.8(C-6)，194.0(C-7)，72.5(C-8)，27.1(C-9)，27.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物11為8-hydroxyphellandra。

化合物12無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z209 [M + H]+，分子式C13H20O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.53(1H，dd，J=16.0，10.0 Hz，H-7)，6.10(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，5.63(1H，br s，H-4)，4.27(1H，s，H-3)，2.50(1H，d，J=10.0 Hz，H-6)，2.26(3H，s，H-10)，1.84(1H，dd，J=13.5，6.0 Hz，H-2a)，1.62(3H，s，H-13)，1.41(1H，dd，J=13.5，6.0 Hz，H-2b)，1.03(3H，m，H-11)，0.89(3H，s，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.0(C-1)，44.0(C-2)，65.6(C-3)，126.0(C-4)，135.0(C-5)，54.4(C-6)，147.3(C-7)，133.8(C-8)，199.0(C-9)，27.0(C-10)，29.5(C-11)，24.8(C-12)，22.8(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定化合物12為(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one。

化合物13無(wú)色油狀(甲醇)；ESI-MS：m/z245 [M + Na]+，分子式C14H22O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：2.55(2H，m，H-8)，2.17(3H，s，H-14)，2.13(1H，m，H-1a)，2.06(2H，m，H-2)，2.03(1H，t，J=6.0 Hz，H-1b)，1.85(1H，dd，J=9.5，5.0 Hz，H-10)，1.78(1H，m，H-11)，1.73(1H，ddd，J=10.0，7.0，3.5 Hz，H-7a)，1.65(1H，m，H-7b)，1.64(1H，m，H-4)，0.91(3H，d，J=4.0 Hz，H-12)，0.90(3H，d，J=4.0 Hz，H-13)，0.67(1H，m，H-6)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：23.07(C-1)，32.9(C-2)，214.4(C-3)，34.6(C-4)，30.1(C-5)，46.5(C-6)，24.9(C-7)，41.8(C-8)，208.9(C-9)，28.05(C-10)，31.15(C-11)，19.70(C-12)，19.34(C-13)，30.1(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定化合物13為saniculamoid D。

化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

2.2 化合物降糖活性篩選

從高山蓍的二氯甲烷部位中分離純化得到化合物1～13，在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2-IR細(xì)胞模型上進(jìn)行了細(xì)胞耗糖量的活性篩選。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)化合物1～13(50 μmol/L)和不同濃度棕櫚酸的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，250 μmol/L棕櫚酸為HepG2細(xì)胞生存的最大劑量(細(xì)胞活力 >90%)。不同濃度(0～350 μmol/L)的棕櫚酸處理可降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，200 μmol/L的棕櫚酸處理可顯著降低HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗(見(jiàn)表1)。化合物1～13(50 μmol/L)作用24 h，對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，并且對(duì)分離鑒定的13個(gè)化合物在棕櫚酸(200 μmol/L)誘導(dǎo)的HepG2-IR細(xì)胞模型上進(jìn)行了細(xì)胞耗糖量的活性篩選(見(jiàn)表2)，結(jié)果顯示化合物5、9和10(50 μmol/L)具有良好的逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗活性。

表1 不同濃度棕櫚酸的細(xì)胞毒性和葡萄糖消耗量Table 1 Cytotoxicity and glucose consumption in different concentrations of palmitic acid

表2 化合物1～13的細(xì)胞毒性和葡萄糖消耗量Table 2 Cytotoxicity and glucose consumption of compounds 1～13

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3 結(jié)論

運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)菊科植物高山蓍的二氯甲烷部位進(jìn)行提取分離，得到單體化合物13個(gè)。化合物1～4、6、8和10～13為首次從該屬植物中分離得到，化合物5、7和9為首次從高山蓍中分離得到。并對(duì)這些化合物在PA誘導(dǎo)的HepG2-IR細(xì)胞模型上進(jìn)行了細(xì)胞耗糖量的活性篩選，結(jié)果顯示化合物5、9和10具有良好的逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗活性，豐富了具有降糖活性的先導(dǎo)化合物的種類。經(jīng)查閱高山蓍的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分類研究較少，藥理方面對(duì)細(xì)胞毒性和降糖活性方面的研究極少。因此，我們對(duì)該植物進(jìn)行提取分離得到單體化合物并進(jìn)行降糖活性篩選，結(jié)果顯示部分化合物具有明顯的逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗活性，對(duì)該植物的化學(xué)成分種類進(jìn)行了豐富，并為后續(xù)學(xué)者探究其藥理活性奠定基礎(chǔ)。