華南吳萸的化學成分及抗炎活性研究

李 燕，許耀軍，祖雪丹，李曉莉，張芮菡，張興杰，肖偉烈,2*

1云南大學藥學院 教育部自然資源藥物化學重點實驗室；云南特色植物提取實驗室；云南省天然產物轉化與應用重點實驗室；2云南大學云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650091

吳茱萸(Euodiarutaecarpa)為蕓香科、吳茱萸屬植物，是一種著名的中藥。在傳統的東方醫學中用于治療胃腸道疾病、頭痛、閉經和產后出血[1]，是非常流行的多用途草本植物。在植物化學的研究中，從吳茱萸的果實中發現了多種化合物，包括：檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿，以及其他多種生物堿和揮發油成分[2]。其中生物堿和檸檬苦素類化合物已被證明有很好的心腦血管活性、抗腫瘤活性以及抗炎鎮痛活性[3，6]。華南吳萸(EuodiaaustrosinensisHand-Mazz)[7]同屬于吳茱萸屬，早期在藥材市場上作為一種吳茱萸的混偽品，與吳茱萸有極高的相似性。鑒于從吳茱萸中分離出較多有價值的化合物，而目前有關于華南吳萸的化學成分未見報道，因此本研究選取華南吳萸的地上枝葉部分進行研究。

吳茱萸的化學成分有很好的抗炎鎮痛活性[8,9]，為驗證華南吳萸的化學成分是否也會有相似的活性，故而對化合物進行抗炎活性相關測試。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一種穩定的胞漿酶，存在所有的細胞中。當細胞炎癥被激活時，細胞膜表面便會打孔，乳酸脫氫酶通過受損的細胞膜釋放到細胞培養液中。因此，檢測LDH在細胞培養液中的釋放水平，便可以表征藥物的抗炎能力[10]。故而本研究用LDH法表征化合物的抗炎活性，以期發現具有抗炎活性的化合物，為炎癥性相關疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料和試劑

核磁共振儀(NMR)AVANCEIIIHD 400/600 MHz(瑞士Bruker公司)；Agilent 1260高效液相(HPLC)(美國Agilent科技有限公司)；二極管陣列檢測器(DAD)(美國Agilent科技有限公司)；Zorbax SB-C18(5 μm，9.4 mm×250 mm)半制備柱(美國Agilent科技有限公司)；Zorbax SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)分析柱(美國Agilent公司)；正相柱層析用硅膠80～100、100～200、200～300目；反相填充材料Lichroprep RP-18(40～60 μm)；羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20；薄層層析硅膠(GF254)；厚制備版(HSGF254)；聚酰胺薄層板；不同目數的柱層析填料硅膠和聚酰胺薄層板均購自青島海洋化工。活性測試所用實驗材料：小鼠單核巨噬細胞株(J774A.1)；Opti-MEM培養基(Thermo Scientific USA，31985088)；尼日亞菌素Nigericin(Invivogen USA，tlrl-nig)；乳酸脫氫酶檢測試劑盒(Promega USA，J2381)；胎牛血清FBS(Thermo Scientific USA；10091155)；DMEM培養基(Gibco，C11995500BT)。

1.2 植物樣品來源

植物于2019年采自云南西雙版納，由中國科學院昆明植物研究所陳渝鑒定為華南吳萸(EvodiaaustrosinensisHand-Mazz)，標本存放于云南大學教育部自然資源藥物化學重點實驗室，標本編號為XWL2019020。

1.3 提取與分離

干燥的華南吳萸細枝和葉(7 kg)粉碎，室溫下用95%甲醇-水溶液(25 L)浸泡24 h，將提取液減壓濃縮得到黑色浸膏(2 kg)，將其溶解在水溶液中得到水相，分別用溶劑PE、EtOAc萃取得到相應的有機相。將PE餾分減壓濃縮，得到褐黑色膠狀物(613.1 g)，將EtOAc餾分減壓濃縮，得到褐黑色膠狀物(338.2 g)。取石油醚相萃取物(FrA)用大孔樹脂層析粗分，用甲醇-水梯度洗脫(體積分數50%、70%、80%、90%)，得4個組分FrA1～4。組分FrA3(56.2 g)以石油醚:乙酸乙酯(10∶1、8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1)為洗脫劑，經薄層色譜檢查后合并相同部分，得15個組分(1～15)。FrA3-14組分經重結晶得到化合物1(1 000.0 mg)。FrA3-8組分經過硅膠柱層析和羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20分離得到化合物8(8.0 mg)、13(5.1 mg)。FrA3-17組分通過硅膠柱層析純化得到化合物6(12.6 mg)、7(6.1 mg)和9(30.6 mg)；經分析半制備高效液相色譜用乙腈-水(3 mL/min，40∶60)得到化合物12(4.3 mg，tR=8 min)。組分FrA2(45.0 g)以二氯甲烷-甲醇(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)為洗脫劑，經薄層色譜檢查后合并相同部分，得9個組(1～9)。組分FrA2-1再次經過硅膠柱層析、厚制備板純化得到化合物3(3.2 mg)；經分析半制備高效液相色譜用乙腈-水(3 mL/min，35∶65)得到化合物4(4 000.0 mg，tR=15.5 min)。組分FrA2-2以二氯甲烷-丙酮(100∶1→1∶1)為洗脫劑得到化合物2(12.9 mg)、5(12.3 mg)。取乙酸乙酯相萃取物(FrB)用大孔樹脂層析粗分，再用甲醇-水梯度洗脫(體積分數50%、70%、80%、90%)得4個組分FrB1～4。組分FrB2(34.0 g)以二氯甲烷-甲醇(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)為洗脫劑，經薄層色譜檢查后合并相同部分，得9個組分(1～9)。FrB2-3組分再次分別通過二氯甲烷-丙酮(100∶1→1∶1)和二氯甲烷-甲醇(100∶1→1∶1)硅膠柱層析得到化合物11(9.0 mg)；經分析半制備高效液相色譜用乙腈-水(3 mL/min，60∶40)分離得到化合物10(12.8 mg，tR=9 min)。

1.4 LDH釋放抑制率測試

本研究采用LDH法[11]，用含10%胎牛血清FBS的DMEM培養基培養J774A.1細胞，在細胞對數生長期將細胞鋪在24孔板中，細胞密度為1×105個/孔，過夜培養細胞之后以200 ng/mL的脂多糖(LPS)誘導刺激細胞3 h，后用待測化合物在工作濃度為10 μmol/L[12]下孵育細胞30 min，最后用10 μmol/L尼日亞菌素(nigericin)刺激孵育1 h，激活后用LDH分析試劑盒檢測細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)的釋放抑制率。將實驗分為四組，分別是正常組(不加脂多糖LPS和尼日亞菌素刺激)、模型組(加入脂多糖和尼日亞菌素刺激)、陽性對照組(在模型組中加入30 μmol/L穿心蓮內酯)和實驗組(在模型組中加入待測化合物)，測試了分離鑒定的化合物在10 μmol/L濃度下對細胞培養液中LDH釋放的抑制率。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物2白色無定型粉末;ESI-MS：m/z545 [M+H]+，分子式為C28H32O11；1H NMR(400 MHz，Pyridine-d5)δ：7.66(1H，br s，H-23)，7.56(1H，d，J= 1.6 Hz，H-21)，6.55(1H，d，J= 2.0 Hz，H-22)，5.77(1H，d，J= 7.5 Hz，H-6)，5.24(1H，s，H-17)，5.04(d，J= 5.7 Hz，H-12β)，4.73(1H，d，J= 13.0 Hz，H-19b)，4.66(1H，d，J= 13.0 Hz，H-19a)，4.33(1H，d，J= 3.6 Hz，H-1)，3.34(1H，s，H-15)，3.09(1H，d，J= 10.4 Hz，H-5)，2.82(1H，d，J= 12.6 Hz，H-9)，2.66(1H，dd，J= 15.7，3.2 Hz，H-2a),2.57(1H，dd，J= 14.6，3.5 Hz，H-2b)，2.18(3H，s，-OAc)，1.33(3H，s，H-29)，1.28(3H，s，H-28)，1.27(3H，s，H-30)，1.22(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，Pyridine-d5)δ：80.2(C-1)，36.8(C-2)，170.7(C-3)，80.8(C-4)，55.2(C-5)，73.6(C-6)，208.2(C-7)，51.9(C-8)，48.8(C-9)，47.0(C-10)，30.8(C-11)，60.7(C-12)，39.2(C-13)，67.7(C-14)，55.2(C-15)，168.1(C-16)，78.6(C-17)，18.4(C-18)，66.1(C-19)，121.6(C-20)，142.4(C-21)，111.0(C-22)，144.1(C-23)，22.4(C-28)，30.6(C-29)，18.1(C-30)，171.0(C-31)，20.9(C-32)。上數據與文獻[14]一致，故鑒定化合物2為6α-乙酰氧基-12α-羥基吳茱萸內酯醇。

化合物1～13化學結構見圖1。

圖1 化合物1～13的結構Fig.1 Structures of compounds 1-13

2.2 LDH釋放抑制率測試結果

本研究對分離得到的化合物進行LDH釋放抑制率檢測，實驗結果采用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統計分析，化合物對LDH釋放抑制率如圖2所示。結果表明化合物13在濃度為10 μmol/L時的LDH釋放抑制率在50%以上，證明該濃度下可以將細胞LDH釋放率明顯降低，具有一定的抗炎活性。

圖2 化合物的乳酸脫氫酶釋放抑制率Fig.2 LDH release inhibition rate of compounds注：與模型組對照，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

3 結論

本研究從華南吳萸中分離得到13個化合物，并且通過核磁共振波譜、質譜等技術對這些化合物的結構進行了鑒定，其中6、8、9和12為首次從吳茱萸屬植物中分離得到，其余化合物均為首次從華南吳萸中分離得到，豐富了吳茱萸屬的化學成分及化學結構的多樣性。對合物進行了LDH釋放抑制活性測試，其中化合物13具有較好的抑制效果，證明其具有一定的抗炎活性，為華南吳萸的抗炎藥用開發利用提供了參考。本研究對明晰華南吳萸的化學成分構成及藥效物質基礎提供了一定的參考依據。