千層塔中脂肪族類化學成分的抗腫瘤活性研究

曹 朵，李佳慧，侯夢陽，王 燕，李 濤*

1延安大學生命科學院；2延安大學紅棗重點實驗室，延安 716000；3安徽理工大學醫學院，淮南 232000；4大連理工大學生物工程學院，大連 116000；5上海市普陀區利群醫院，上海 200333

千層塔LycopodiumserratumThunb.，又名蛇足石杉或蛇足草，為石杉科屬植物，通常高10～30 cm，孢子葉的兩側可見淡黃色腎形孢子囊[1]。千層塔主要分布在我國華南地區和其他亞洲國家(日本、泰國、菲律賓和馬來西亞等)，生長在海拔300～2 700 m的森林或灌木叢下[1]。在我國民間療法中，千層塔的使用已有一千多年的歷史，其化學成分主要有石松類生物堿和三萜[2]。在臨床上，生物堿已成功用于治療重癥肌無力，阿爾茨海默氏病和癡呆癥[3]。

天然產物具有結構多樣性和新穎性，是藥物先導分子的重要來源[4]。該植物中化學成分主要結構類型有生物堿、三萜類和脂肪族類化合物等，其中生物堿表現出膽堿酯酶抑制活性，三萜類表現出抗腫瘤活性，但有關其脂肪族類化合物的生物活性鮮有報道[5]。

康萊特注射液是一種用于治療脾虛、小細胞肺癌、肺癌、原發性肝癌和肝癌的藥物，其有效成分有甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和脂肪酸烴酯等脂肪族類化合物[6]。本研究意圖通過對千層塔中脂肪族化合物進行富集、分離和純化，并對分離到的單體化合物進行抗腫瘤活性篩選。在前期的預實驗中，我們初步發現千層塔全株藥材提取后氯仿層萃取部位具有抑制HepG2細胞的生物活性。結合多種現代分離純化技術對千層塔中化學成分進行較系統的分離，通過波譜學方法對分離得到的化學成分進行結構表征，并對所分離到的單體化合物進行HepG2細胞抑制活性檢測，以期為千層塔的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高分辨ESI質譜儀(Agilent Series，1100 SL液質聯用儀)；1D和2D核磁共振(Bruker，Avance 500和AV 800型)；旋轉蒸發儀(中國上海亞榮生化儀器有限公司，RE-6000A及RE3000A型)；半制備高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司，漢邦NP7000C型泵，NU3000型紫外檢測器)；RP-18色譜柱(日本YMC公司，250 mm × 4.6 mm，5 μmol/L；250 mm × 10 mm，10 μmol/L)；正相柱層析硅膠(青島海洋化工廠，100～200、200～300、300～400目)；薄層層析硅膠(青島海洋化工廠，GF254)；大孔樹脂(中國北京慧德易科技有限責任公司，AB-8)；RP-18反相硅膠填料(上海技舟化工科技有限公司，30和60 μmol/L，100 A)；有機試劑(天津科密歐化學試劑有限公司，分析純)；HepG2細胞(Procell，武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 藥材來源與鑒定

千層塔藥材購于湖北省恩施市，全株暗綠色、高15～40 cm、根須狀、莖直立或下部平臥、葉紙質、橢圓狀披針形，葉緣具粗齒，經西北大學生命科學學院郭斌研究員鑒定為石松科(Lycopodiaceae P.Beauv.ex Mirb.)石杉屬(HuperziaBernh)植物千層塔LycopodiumserratumThunb.全株藥材，該中藥標本存放于西北大學生命科學院(編號：17-03-10)。

1.3 提取與分離

取千層塔干燥全株19 kg，粉碎后加10倍量的甲醇加熱回流，反復提取4次，每次約2 h，過濾后合并濾液，65 ℃下減壓濃縮得到浸膏約5.5 kg。將浸膏分為3份，每份加5 L酸水(pH 2.5的醋酸水溶液)，超聲使其充分溶解后，過濾得濾液，加入NaCO3調節濾液至堿性(pH 10～11)后，分別加入與堿水等體積的石油醚、氯仿或乙酸乙酯進行萃取，每份萃取3次，分別合并水層、石油醚層、氯仿層和乙酸乙酯層萃取液，減壓濃縮有機相，得到石油醚層約2.0 kg、氯仿層浸膏約1.5 kg和乙酸乙酯層浸膏約500 g，對石油醚部位、氯仿部位和乙酸乙酯部位粗提物進行生物活性篩選，結果顯示氯仿層顯示出抗腫瘤活性。取氯仿層浸膏1.4 kg，采用AB-8大孔樹脂柱分離純化，乙醇/水(0∶100、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10和100∶0)梯度洗脫，TLC檢測合并相似組分，氯仿部位得Fr.A～G，其中Fr.B和Fr.D顯示出較好的抗腫瘤活性。Fr.B進一步通過RP-18反相硅膠填料常壓柱層析分離，甲醇/水(30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶20和90∶0)梯度洗脫，TLC檢測后合并得Fr.B1～B6。Fr.B3通過MCI柱色譜分離純化，甲醇/水洗脫(40∶60、50∶50、60∶40、70∶30和80∶20)得到5個組分Fr.B31～B35。Fr.B32(320 mg)再經常壓RP-18反相硅膠柱層析得到6個組分Fr.B321～226。Fr.B323(116.8 mg)經半制備液相HPLC(乙腈/水)純化得到化合物3(9.65 mg)、7(10.29 mg)、9(13.32 mg)。Fr.B324(202 mg)經半制備液相HPLC(甲醇/水=35∶65)純化得到化合物6(12.34 mg)、2(7.67 mg)、1(8.56 mg)。Fr.D(約219 g)經中性氧化鋁柱層析，二氯甲烷/甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫，TLC檢測合并得Fr.D1～D6。其中Fr.D3(約91 g)經常壓正相硅膠柱層析，氯仿/甲醇(100∶0→0∶100，1%三乙胺，V/V)梯度洗脫，TLC檢測后合并得到5個組分Fr.D31～D35。其中Fr.D33(約400 mg)再經Sephadex LH 20凝膠柱層析，甲醇洗脫，TLC檢測得到5個部分Fr.D331～D335。Fr.D333(101 mg)和Fr.D334(約132 mg)再經半制備液相HPLC分離得到化合物4(10.60 mg)、5(7.54 mg)、8(6.43 mg)。

1.4 抑制HepG2細胞活性的粗提物和活性物質篩選

將裝有HepG2細胞培養液的75 cm2培養瓶放置在37 ℃、5% CO2條件下培養，隔天換一次培養液，待細胞密度打到80%以上，按照1∶3傳代。將細胞以5×104個/mL的密度接種于96孔板，100 μL/孔。將96孔板放入培養箱在37 ℃、5% CO2的條件下預培養24 h。

對HepG2細胞進行培養、傳代、活性檢測及細胞存活率計算，其中細胞培養液中提取液的供試品溶液濃度為1 mg/mL，萃取物的供試品液濃度為100 μg/mL，化合物供試品溶液的濃度梯度為1、3、10、30和100 μmol/L。

1.5 統計分析

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1白色無定形粉末，易溶于甲醇和氯仿;HR-ESI-MS：m/z393.346 8 [M+H]+(calcd for C25H45O3，393.354 3)，提示其分子式為C25H44O3。1H NMR譜(見表1)在高場顯示2個sp3雜化甲基峰δH0.90(3H，t，J= 7.1 Hz)和0.98(3H，t，J= 7.4 Hz)，4個烯烴氫質子δH5.34(2H，td，J= 4.6，2.3 Hz)、7.64(1H，dd，J= 5.7，3.3 Hz)及7.71(1H，dd，J= 5.6，3.3 Hz)，提示化合物1有4個順式烯烴氫質子。13C NMR和DEPT數據(數據見表1)提示化合物1含有25個碳，其中2個甲基碳、17個亞甲基碳、4個次甲基不飽和碳(δC129.8、130.8、130.8、132.3)和2個季碳。HSQC譜中顯示δH7.64(1H，dd，J= 5.7，3.3 Hz)與δC132.3相關，δH7.71(1H，dd，J= 5.6，3.3 Hz)與δC129.8相關，δH5.34(2H，td，J= 4.6，2.3 Hz)與δC130.8相關，δH4.29(2H，t，J= 6.6 Hz)與δC66.6存在相關性，δH2.19(2H，m)與δC36.5相關，δH2.03(2H，d，J= 6.6 Hz)與δC28.1相關，δH1.59(2H，m)與δC26.9相關，δH1.45(2H，m)與δC23.7相關，δH1.34(1H，m)與δC20.2相關，δH0.90(3H，t，J= 7.1 Hz)與δC14.4相關，δH1.32(2H,m)與δc31.7相關，δH1.31(2H,m)與δc33.0相關，δH0.98(3H，t，J= 7.4，3.2 Hz)與δC14.0相關。HMBC譜中顯示2個羰基碳δC169.3和179.3分別與1H NMR譜中δH7.71(1H，dd，J= 5.6，3.3 Hz)和δH7.64(1H，dd，J= 5.7，3.3 Hz)相關，提示雙鍵碳(δC129.8，132.3)兩端均連有羰基；其中羰基碳δC179.3與δH2.19(2H，m)相關，提示該羰基與亞甲基碳δC36.5相連；δC36.5與δH5.34(2H，td，J= 4.6，2.3 Hz)相關，提示亞甲基碳與雙鍵碳連接；δH2.03(2H，d，J= 6.6 Hz)與δC130.8相關；1H-1H COSY譜中δH2.03(2H，d，J= 6.6 Hz)與烯烴氫質子δH5.34(2H，td，J= 4.6，2.3 Hz)相關，提示雙鍵碳與亞甲基δH5.34(2H，td，J= 4.6，2.3 Hz)相連，1H-1H COSY譜中還可見δH4.29(2H，t，J=6.6 Hz)與δH1.32(2H，m)相關，δH1.34(2H，m)與δH1.31(2H，m)和δH0.98(3H，t，J=7.4 Hz)相關，δH0.98(3H，t，J=7.4 Hz)與δH1.34(2H，m)相關，δH1.32(2H，m)與δH1.34(2H，m)和δH1.31(2H，m)相關。另外，在HMBC譜中δH4.29(2H，t，J=6.6 Hz)與δC31.7和δC20.2相關，δH0.98(3H，t，J=7.4 Hz)與δC20.2和δC31.7存在相關性，δC20.2與δH1.32(2H，m)及δH1.31(2H，m)相關；結合HMBC譜和1H-1H COSY譜提示正戊醇片段的存在。在HMBC譜中還可見δH4.29(2H，t，J=6.6 Hz)與δC169.3羰基碳存在相關性，提示羰基碳與正戊醇成酯；HMBC譜中δC23.7與甲基質子δH0.90(3H，t，J=7.1 Hz)和δH1.59(2H，m)相關(見圖1)。綜合以上信息推測化合物1的結構為pentyl-4-oxoicosa-2(Z)，6(Z)-dienoate，Scifinder數據庫檢索顯示化合物1為新化合物。化合物1和2的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1的關鍵HMBC和1H-1H COSY相關Fig.1 The key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數據(800和200 MHz，CDCl3)Table 1 1H NMR and 13C NMR data for compound1 (800 and 200 MHz,CDCl3)

化合物2白色無定形粉末，易溶于甲醇和氯仿;HR-ESI-MS：m/z257.099 3 [M+Na]+(calcd for C10H18O6Na，257.087 4)，提示其分子式為C10H17O6。1H NMR譜(見表2)在高場顯示3個sp3雜化甲基峰δH0.93(3H，d，J= 6.6 Hz)、1.00(3H，d，J= 6.6 Hz)和1.30(3H，t，J= 7.1 Hz)。13C NMR和DEPT數據(數據見表1)提示化合物2含有10個碳，其中3個甲基碳、2個亞甲基碳、2個次甲基碳1個季碳(δC80.0)和2個羰基碳(δC171.5和177.0)。HSQC譜中顯示δH1.30(3H，t，J= 7.1 Hz)與δC14.2相關、δH0.93(3H，d，J= 6.6 Hz)與δC23.7相關，δH1.00(3H，d，J= 6.6 Hz)與δC24.1相關，δH1.82(1H，m)和δH1.87(1H，dd，J= 14.5，6.1 Hz)與δC24.4均相關，δH4.25(1H，dq，J= 10.7，7.2 Hz)和δH4.32(1H，dq，J= 10.8，7.2 Hz)均與δC62.9相關，δH4.39(1H，s)與δC80.0相關。HMBC譜中顯示δH4.25和δH4.32均與δC14.2相關，δH4.39與δC43.5相關，δH4.25與δC76.0相關，δH1.82、δH1.87和δH2.00均與δC80.0相關，δH1.30與δC62.8相關，δH2.00和δH4.39與δC177.0均相關，δH4.25和δH4.32與δC171.5均相關，δH1.00和δH0.93與δC43.5均相關，δH1.00與δC24.1和δC24.4均相關，0.93與24.4相關。1H-1HCOSY譜中顯示δH1.82和δH1.87與δH0.93均相關，δH2.00與δH1.87相關，δH4.25和δH4.32與δH1.30均相關(見圖2)。綜合以上信息推測化合物2的結構為2-(2-ethoxy-1-hydroxy-2-oxoethyl)-2-hydroxy-4-methylpentanoic acid，Scifinder數據庫檢索顯示化合物2為新化合物。

圖2 化合物2的關鍵HMBC和1H-1H COSY相關Fig.2 The key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 2

表2 化合物2的1H NMR和13C NMR數據(800和200 MHz，CDCl3)Table 2 1H NMR and 13C NMR data for compounds 2 (800 and 200 MHz,CDCl3)

續表2(Continued Tab.2)

化合物3白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿；1H NMR(800 MHz，DMSO-d6)δ：5.37～5.31(1H，m，H-9)，4.04(1H，q，J= 7.1 Hz，H-10)，3.57(1H，d，J= 1.5 Hz，H-13)，2.74(1H，t，J= 7.0 Hz，H-14)，3.31(2H，s，H-12)，2.31～2.24(2H，m，H-11)，2.02(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，1.56(1H，d，J= 1.2 Hz，H-1′)，1.17(3H，t，J= 7.1 Hz，H-24)；13C NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ：173.3(C-1)，14.6(C-2)，22.3(C-3/C-4)，23.4(C-5/C-6)，20.9(C-7)，30.2(C-8)，130.2(C-9/C-10)，34.0(C-11)，128.3(C-12)，128.3(C-13)，31.4(C-14)，29.4(C-15)，29.2(C-16)，29.0(C-17)，28.9(C-18)，28.9(C-19)，27.1(C-20)，25.7(C-21)，24.9(C-22)，22.4(C-23)，14.4(C-24)，60.1(C-1′)。以上數據與文獻[7]報道一致，故鑒定該化合物為ethyl (9Z,12Z)-octadeca-9。

化合物4白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：5.34(2H，m，H-10/H-11)，2.38(2H，t，J= 10.7 Hz，H-9)，2.16(4H，m，H-8)，0.88(3H，t，J= 10.9，2.2 Hz，H-19)；13C NMR(200 MHz，CD3OD)δ：201.0(C-1)，47.9(C-2)，29.4(C-3)，29.3(C-4)，29.3(C-5)，29.2(C-6)，29.2(C-7)，29.2(C-8)，35.1(C-9)，129.4(C-10/C-11)，31.7(C-12)，29.1(C-13)，29.1(C-14)，28.9(C-15)，26.7(C-16)，25.5(C-17)，22.3(C-18)，13.0(C-19)。以上數據與文獻[8]報道一致，故鑒定該化合物為(Z)-nonadec-10-enal。

化合物5白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，DMSO-d6)δ：7.03(2H，NH2)，0.88(3H，t，J= 10.8 Hz，H-22)；13C NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ：174.9(C-1)，35.6(C-2)，26.6(C-3)，24.1(C-4/C-5)，22.1(C-6/C-7)，31.7(C-8)，130.1(C-9/C-10)，29.5(C-11)，29.5(C-12)，29.4(C-13)，29.3(C-14)，29.3(C-15)，29.2(C-16)，29.2(C-17)，29.0(C-18)，27.0(C-19)，25.6(C-20)，22.6(C-21)，14.4(C-22)。以上數據與文獻[9]報道一致，故鑒定該化合物為油酸酰胺。

化合物6白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：0.87 (2H，s，H-18)，2.35(4H，t，J= 7.5 Hz，H-8)，4.24(1H，ddd，J= 10.8，5.7，1.2 Hz，H-17)，7.53(1H，dd，J= 5.7，3.2 Hz，H-9)，7.71(1H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-10)；13C NMR(200 MHz，CD3OD)δ：178.0 (C-1)，35.1(C-2)，31.7(C-3)，29.4(C-4)，29.4(C-5)，29.3(C-6)，29.3(C-7)，29.2(C-8)，129.5(C-9)，129.5(C-10)，29.2(C-11)，29.1(C-12)，28.9(C-13)，28.9(C-14)，26.7(C-15)，25.5(C-16)，22.3(C-17)，13.1(C-18)，以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定該化合物為反式-9-十八碳烯酸。

化合物7白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，DMSO-d6)δ：0.84(6H，d，J=6.4 Hz，H-11/H-12)，2.78(1H，dd，J=16.4，9.6 Hz，H-2′′)，4.60(1H，ddd，J=9.6，7.6，6.0 Hz，H-1′)，8.32(1H，d，J=7.6 Hz，NH)；13C NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ：55.9(C-1)，175.4(C-2)，35.8(C-3)，25.6(C-4)，28.4(C-5)，29.4(C-6)，29.8(C-7)，26.5(C-8)，38.7(C-9)，26.5(C-10)，22.6(C-11)，22.1(C-12)，50.0(C-1′)，170.6(C-2′)，35.9(C-3′)，172.4(C-1′′)，52.0(C-2′′)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定該化合物為bacillamidin A。

化合物8白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，CDCl3)δ：0.80 (3H，t，J=11.4，2.0 Hz，H-22)，0.88(3H，t，J=11.1，1.9 Hz，H-1)，5.29 (1H，m，H-10)，5.43(1H，m，H-9)，5.38(2H，m，H-3/H-4)，5.43(2H，m，H-6/H-7)；13C NMR(200 MHz，CDCl3)δ：14.6(C-1),15.0(C-2)，131.3(C-3)，129.9(C-4)，31.9(C-5)，128.1(C-6)，128.0(C-7)，29.7(C-8)，127.0(C-9)，126.9(C-10)，29.7(C-11)，29.6(C-12)，29.5(C-13)，29.4(C-14)，29.3(C-15)，29.3(C-16)，27.2(C-17)，25.6(C-18)，25.4(C-19)，22.7(C-20)，19.8(C-21)，14.1(C-22)，以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定該化合物為(3Z，6Z，9Z)-3，6，9-docosatriene。

化合物9白色無定形粉末(氯仿)，易溶于氯仿和二氯甲烷；1H NMR(800 MHz，CDCl3)δ：0.89(3H，t，J=10.9，3.3 Hz，H-17)，0.90(3H，t，J=11.2，3.2 Hz，H-1)，5.61(1H，dd，J=5.8，1.9 Hz，H-10)，5.62(1H，m，H-10)；13C NMR(200 MHz，CDCl3)δ：18.0(C-1)，29.8(C-2)，64.2(C-3)，79.8(C-4)，69.1(C-5)，69.0(C-6)，79.6(C-7)，59.3(C-8)，134.8(C-9)，127.8(C-10)，27.2(C-11)，29.6(C-12)，29.5(C-13)，29.3(C-14)，22.6(C-15)，31.1(C-16)，14.1(C-17)，以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定該化合物為oplopandiol。

化合物1～9的結構式見圖3。

圖3 化合物1～9的化學結構Fig.3 The chemical structures of compounds 1-9

2.2 抑制HepG2細胞活性評價

按預先設定各孔加入10 μL的PBS和供試液，各平行5孔。有HepG2細胞但不加供試液只加PBS的一組作為對照組，有培養液但不加HepG2細胞和供試液只加PBS的一組作為空白組。在培養箱中孵育36 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育1.5 h后在490 nm下用酶標儀測定OD值，并計算細胞存活率，結果顯示化合物1和化合物3對HepG2細胞具有抑制作用(見圖4)，其IC50分別為41.12、80.54 μmol/L，表明化合物1對HepG2細胞活性有明顯抑制作用。

圖4 千層塔萃取部位以及化合物1和3對HepG2細胞存活率的影響Fig.4 Effects of extractions and compounds 1 and 3 from H.serrata on the survival rate of HepG2 cells注：與對照組相比，*P<0.05，****P<0.000 1。Note:Compared with control group,*P<0.05,****P<0.000 1.

3 結論

本研究對千層塔全株藥材進行酸提堿沉獲得提取液，萃取后對活性部位氯仿層進行分離純化，共分離鑒定了9個脂肪族類化合物，其中化合物1和2為新化合物，化合物3～9首次從千層塔中分離，對分離到的單體化合物進行了體外抑制HepG2細胞活性檢測。

千層塔中脂肪族類化合物尚未被學者們研究，本實驗首次報道了千層塔中9個脂肪族類化合物。前期藥理活性實驗中發現千層塔粗提物氯仿萃取層具有抑制HepG2細胞活性的作用，對其進行了較為系統的分離純化，對脂肪族類化合物生物活性的篩選得益于康萊特藥物的啟發。康萊特的有效成分為薏苡仁油，主要為甘油三酯類化合物。因此，我們對分離到的9個脂肪族類化合物進行了抗HepG2細胞活性的篩選，結果顯示化合物1和3對HepG2細胞具有抑制作用，IC50分別為41.12、80.54 μmol/L。本研究首次較集中地對千層塔中脂肪族類化合物進行了分離鑒定，在一定程度上豐富了千層塔的化學成分。此外，本實驗首次開展了千層塔單體化合物抑制HepG2細胞抑制活性作用研究，為千層塔的植物化學資源合理開發利用提供參考依據，也為千層塔藥理研究奠定了基礎。