圣草酚調(diào)控Akt/mTOR通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的影響

劉慶龍，鄭相如，李文軍*，劉松青*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝膽胰外科，重慶 401120

膠質(zhì)瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，具有高侵襲性，即便采用手術(shù)加放化療的綜合治療后仍面臨復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[1]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)，是臨床上的一線抗膠質(zhì)瘤藥物。然而，由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)如血液毒性等，這大大限制了TMZ的臨床使用，嚴(yán)重影響了療效[2]。因此，尋求高效、低毒的新型抗膠質(zhì)瘤藥物具有重要意義。

自噬作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，是一個動態(tài)降解和循環(huán)系統(tǒng)[3]。自噬是一個動態(tài)過程，包含吞噬泡(phagophore)，自噬小體(autophagosome)以及自噬溶酶體(autolysosome)三種狀態(tài)[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬的異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。在膠質(zhì)瘤中，自噬的異常調(diào)控可促進(jìn)腫瘤的生長，而通過干預(yù)細(xì)胞自噬可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡進(jìn)而遏制腫瘤的進(jìn)展。因此，以自噬為靶點(diǎn)探尋新的膠質(zhì)瘤治療手段是極具潛力的研究方向[6]。

圣草酚(eriodictyol，ERD)化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，是一種天然的可食用黃酮，廣泛存在于蔬菜和水果中，尤其在柑橘類水中含量最為豐富。研究表明圣草酚具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，圣草酚能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移，但其對自噬的作用目前尚未研究[8,9]。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)探討圣草酚對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和自噬的影響，并進(jìn)一步研究可能的分子機(jī)制，為闡明圣草酚抗膠質(zhì)瘤藥理作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

圖1 ERD的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of ERD

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG和CHG-5(上海中橋新舟生物科技有限公司)。

1.2 動物

4～6周齡SPF級BALA/c裸鼠，雌性，體重17～20 g，購自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。所有動物實(shí)驗(yàn)均通過重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批(2020013號)。

1.3 藥品與試劑

ERD，純度≥98%，由美國Syntech International公司饋贈；Beclin1、LC3Ⅱ、ATG5、P62、Akt、p-Akt、m-TOR、p-mTOR以及β-actin抗體(美國Proteintech公司，Cat.No.11306-1-AP、14600-1-AP、10181-2-AP、18420-1-AP、60203-2-Ig、66444-1-Ig、66888-1-Ig、67778-1-Ig、66009-1-Ig)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)(美國Bimake公司，Cat.No.B34304)；GFP-mRFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒(上海海吉浩格生物科技有限公司，Cat.No.5820)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(以色列Biological Industries公司，Cat.No.06-1055-57-1A、04-010-1A)。

1.4 儀器

光學(xué)倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；蛋白凝膠電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國LI-COR Biosciences公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U87-MG和CHG-5細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立與給藥

將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG接種于裸鼠右臀皮下，建立皮下移植瘤模型。待腫瘤體積生長至50 mm3左右時，將裸鼠隨機(jī)分為4組，即對照組(CON)、50 mg/kg ERD組、100 mg/kg ERD組以及200 mg/kg ERD組，每組5只。各給藥組腹腔注射相應(yīng)劑量的ERD，CON組注射同體積溶劑，每日一次，每3日測量裸鼠體重及腫瘤體積，連續(xù)給藥3周后處死小鼠。

1.5.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將U87-MG和CHG-5細(xì)胞以3 × 103的密度種植于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，ERD(0～400 μmol/L)處理24、48、72 h后使用CCK-8檢測細(xì)胞活力。

1.5.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將U87-MG和CHG-5細(xì)胞以500個每孔接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，ERD(0～100 μmol/L)處理12天，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色、拍照、計數(shù)、統(tǒng)計分析。

1.5.5 GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

將約5 × 104個293T細(xì)胞種植于6 cm培養(yǎng)皿中，次日替換新鮮培養(yǎng)基，加入8 μL Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑，psPAX2質(zhì)粒800 ng，pMD2.G質(zhì)粒200 ng以及GFP-mRFP-LC3B質(zhì)粒1 μg培養(yǎng)過夜。次日，替換新鮮培養(yǎng)基，72 h后收集293T細(xì)胞培養(yǎng)基，過濾得到病毒液。

將U87-MG和CHG-5細(xì)胞以1 × 104的密度種植于24孔板中。次日，將培養(yǎng)基替換為收集的病毒液，并加入0.5 μL Polybrene轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染72 h，將病毒液替換為含2 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.5.6 熒光顯微鏡觀察圣草酚對膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬小體與自噬流的影響

將GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)的U87-MG和CHG-5細(xì)胞分為對照組(CON)和ERD組，以1 × 104的密度種植于24孔板中，ERD組加入含有100 μmol/L ERD的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，CON組為不含藥的完全培養(yǎng)基。48 h后觀察綠色熒光的自噬小體的密度。

將GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)的U87-MG和CHG-5細(xì)胞以1 × 104的密度種植于24孔板中。分別加入不含藥的完全培養(yǎng)基及含有ERD(100 μmol/L)、雷帕霉素(rapamycin，RAP，200 nmol/L)和ERD + RAP的培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡觀察熒光顏色的變化。

1.5.7 Western blot檢測自噬及Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的U87-MG和CHG-5細(xì)胞消化，接種于6 cm皿中，待細(xì)胞貼壁后，給與ERD處理48 h。細(xì)胞蛋白/動物組織，裂解，定量，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃ 孵育一抗過夜，洗膜，室溫孵育二抗2 h，顯影。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 ERD抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG和CHG-5活力

將不同濃度的ERD(0、25、50、100、200、400 μmol/L)與U87-MG和CHG-5細(xì)胞分別共培養(yǎng)24、48、72 h，CCK-8結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的細(xì)胞活力被抑制，且呈劑量—時間依賴性(見圖2A)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0、25、50、100 μmol/L處理細(xì)胞。

圖2 ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力與克隆形成的影響Fig.2 The effect of ERD on the viability and clone formation of glioma cells注：與CON組比較，* P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note:Compared with the CON group,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.

2.2 ERD抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG和CHG-5克隆形成

不同濃度ERD與U87-MG和CHG-5細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著ERD濃度增加，細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少，用ImageJ軟件對克隆細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明ERD能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成(見圖2B、2C)。

2.3 ERD促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG和CHG-5自噬小體的形成

膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)ERD處理48 h后，使用熒光顯微鏡(× 400)觀察發(fā)現(xiàn)與空白對照相比綠色的熒光蛋白LC3B明顯增多(見圖3A)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著ERD濃度增加，自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1和LC3Ⅱ的表達(dá)水平升高(見圖3B)，以上結(jié)果提示，ERD能夠顯著升高膠質(zhì)瘤細(xì)胞中自噬體的數(shù)量。

圖3 ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的影響Fig.3 The effect of ERD on the autophagy of glioma cells注：與CON組比較，**P <0.01，***P <0.001。Note:Compared with the CON group,**P <0.01,***P <0.001.

2.4 ERD抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG和CHG-5的自噬流

ERD(100 μmol/L)、RAP(200 nmol/L)和ERD + RAP處理GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡(× 400)觀察發(fā)現(xiàn)圣草酚使合并后顯黃色熒光，且使RAP處理后合并的紅色熒光減弱，而黃色熒光增加(見圖4A)。另外，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ERD使P62的表達(dá)增加，而RAP部分逆轉(zhuǎn)了ERD的作用(見圖4B、4C)。這提示ERD阻礙了自噬體與溶酶體的融合，抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬流。

圖4 ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬流的影響Fig.4 The effect of ERD on the autophagic flux of glioma cells注：與CON組比較，* P <0.05，**P <0.01，***P <0.001；與ERD組比較，# P <0.05。Note:Compared with the CON group,* P <0.05,**P <0.01,***P <0.001;Compared with the ERD group,# P <0.05.

2.5 ERD下調(diào)Akt/mTOR信號通路

將膠質(zhì)瘤細(xì)胞與不同濃度ERD共培養(yǎng)48 h后，采用Western blot檢測Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與CON組相比，ERD處理后Akt和mTOR的表達(dá)無明顯差異，p-Akt和p-mTOR的表達(dá)水平顯著降低，而Akt激動劑740 Y-P(25 μg/mL)部分逆轉(zhuǎn)了ERD對Akt/mTOR通路的抑制作用，結(jié)果見圖5。提示ERD可能通過下調(diào)Akt/mTOR通路，影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬過程。

圖5 ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響Fig.5 The effect of ERD on the expression of proteins in the Akt/mTOR pathway in glioma cells注：與CON組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001，與ERD組比較，# P <0.05，### P <0.001。Note:Compared with the CON group,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001;Compared with the ERD group,#P <0.05,###P <0.001.

2.6 ERD抑制膠質(zhì)瘤增殖，促進(jìn)膠質(zhì)瘤組織中LC3Ⅱ、P62、Beclin 1、ATG5的表達(dá)，抑制Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)

與CON組相比，ERD給藥后減少了裸鼠皮下移植瘤體積和瘤體重量，其中以ERD中、高劑量組最為顯著(P<0.05)。說明在體內(nèi)ERD同樣對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制作用(見圖6A、6C)。另外，給藥過程中ERD組小鼠體重與CON組無明顯差異，初步表明ERD毒性較小(見圖6D)。Western blot檢測腫瘤組織中LC3、P62、Beclin 1、ATG5和Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在體內(nèi)，ERD同樣能夠上調(diào)LC3、P62、Beclin 1、ATG5的表達(dá)水平同時下調(diào)Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，這與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致(見圖6E、6F)。提示，在體內(nèi)ERD同樣可能通過調(diào)控Akt/mTOR途徑影響膠質(zhì)瘤的自噬過程。

圖6 ERD在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤自噬的影響Fig.6 The effect of ERD on autophagy of glioma in vivo注：與CON組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note:Compared with the CON group,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.

3 討論與結(jié)論

膠質(zhì)瘤是發(fā)生率和死亡率均排在首位的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、惡性進(jìn)展迅速、治愈率極低的特點(diǎn)，其中位生存期不足一年[10]。由于GBM高浸潤性生長的生物學(xué)特性，導(dǎo)致手術(shù)幾乎無法保證腫瘤的完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。因而臨床上通常采用手術(shù)+放化療的綜合治療手段[11]。

目前膠質(zhì)瘤尚無作用理想的治療藥物。臨床上常用的藥物主要包括生物烷化劑、靶向抗腫瘤藥物以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑等[12]。其中TMZ是治療GBM的一線化療藥物，但TMZ選擇性差、易耐藥、副作用強(qiáng)，治療效果往往不理想。靶向抗腫瘤藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有選擇性高、副作用小的特點(diǎn)，在國外已逐漸成為主流抗膠質(zhì)瘤藥物[13]。然而，靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑價格較昂貴，長期使用患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，壓力大。因此，尋求高效低毒且價格適中的新型抗膠質(zhì)瘤藥物是目前腦膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥以及天然活性產(chǎn)物來源十分豐富，種類數(shù)量眾多、毒副作用相對較小，并且具有廣維度、多層次、多靶點(diǎn)綜合作用的特點(diǎn)，在抗腫瘤方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢[14]。所以，從天然活性產(chǎn)物和中醫(yī)藥中探尋有效抗膠質(zhì)瘤成分或許是解決目前困境的有效途徑。

ERD作為一種天然黃酮，因其具有廣泛的生物活性而被關(guān)注和研究。在以往，ERD的研究中主要集中于抗炎和抗氧化作用方面，而近期我們的研究發(fā)現(xiàn)圣草酚能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其凋亡。另外，Tang等[15]研究顯示，在鼻咽癌CNE1細(xì)胞中，ERD通過自噬介導(dǎo)顯著抑制了細(xì)胞的增殖。Wang等[16]研究則表明，ERD通過調(diào)控自噬在大鼠腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了保護(hù)作用。以上研究結(jié)果提示，ERD對細(xì)胞自噬具有調(diào)控作用，并可能通過影響自噬發(fā)揮抗癌作用。

本研究中探討了ERD對膠質(zhì)瘤自噬的影響。首先，我們通過CCK-8試劑和克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有良好的抑制效應(yīng)，這與我們之前的研究結(jié)果一致。接下來，為探究ERD是否對膠質(zhì)瘤自噬有所作用，我們檢測了LC3、Beclin 1和ATG5自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并通過熒光觀察了自噬小體的數(shù)量。結(jié)果顯示，經(jīng)ERD處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LC3 Ⅱ、Beclin 1和ATG5的表達(dá)顯著上調(diào)，自噬小體的數(shù)量也明顯增多。說明ERD誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬。自噬是一個動態(tài)過程，包括吞噬泡、自噬小體和自噬溶酶體三種狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，首先形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)而降解包裹于其中的蛋白等物質(zhì)[17]。我們采用GFP-mRFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)紅-綠熒光蛋白的細(xì)胞，利用GFP熒光蛋白在低PH值條件下熒光強(qiáng)度減弱這一特性觀察自噬流的情況。即當(dāng)自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時，囊泡內(nèi)PH值降低，紅綠熒光合并后細(xì)胞呈現(xiàn)偏紅色熒光，反之則趨向黃色。結(jié)果顯示，ERD處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈亮黃色熒光，且P62蛋白表達(dá)升高，P62為自噬溶酶體的底物，而當(dāng)ERD與自噬流誘導(dǎo)劑——RAP共處理細(xì)胞后，部分逆轉(zhuǎn)了ERD的作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ERD促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬小體的形成，但抑制了自噬流。

Akt/mTOR信號通路在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[18]。因此，為進(jìn)一步探究ERD影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的潛在機(jī)制，我們檢測了ERD對Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，ERD能夠抑制p-Ak與p-mTOR的表達(dá)，而該作用被Akt激動劑740 Y-P部分逆轉(zhuǎn)。說明，ERD可能通過下調(diào)Akt/mTOR通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬過程。最后，我們通過裸鼠皮下移植瘤模型觀察ERD在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤自噬的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同體外一致。

綜上所述，本研究初步探索了ERD對膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的作用。發(fā)現(xiàn)，ERD可能部分通過抑制Akt/mTOR通路，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1、LC3、P62的表達(dá)，影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬過程，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，最終發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。然而，本研究仍未完全闡明ERD調(diào)控自噬流的分子機(jī)制，這有待進(jìn)一步研究。