關于豆豉微生物多樣性和揮發性成分檢測技術及其關聯分析的研究進展

張彥贈,湯曉娟,林祥娜,紀艷青,隋智海,賀紅軍,劉云國*

(1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000)

豆豉作為一種中國傳統發酵食品,有著悠久的歷史。因其具有濃郁、順滑、醇香、咸鮮的味道,成為一種獨特的開胃菜,現已在世界各地廣為流傳[1-2]。近幾年,研究證明,食用豆豉不僅有助于緩解消化不良,而且可以預防前列腺癌和乳腺癌[3]，也證明豆豉提取物具有降血糖以及抗糖尿病的作用[4-5]。因此,豆豉所具有的促進人體健康的特性也引起了廣大學者的關注。

豆豉的制作一般分為前、后兩個時期。前期即制曲階段,該階段微生物對大豆中營養物質如蛋白質、脂肪等進行初步降解,同時產生大量的酶,為后期的發酵過程進一步降解提供條件[6]。后期為后發酵階段,該過程中微生物會將大豆進一步降解成小分子物質,如多肽、氨基酸、短鏈脂肪酸以及各種單糖等,是產生風味物質、功能活性物質以及營養價值的關鍵過程[7]。

據研究,在豆豉的后發酵過程中,微生物多樣性的變化是形成豆豉最終特有風味的核心驅動力[8],對風味的形成發揮關鍵作用。然而只有少數研究對發酵食品及其產生的風味化合物進行相關性分析,探究發酵食品中的功能核心微生物群。因此，在研究豆豉微生物多樣性和揮發性成分的變化的基礎上,利用相關性分析,進一步探究微生物種群與揮發性化合物之間的關系,將有助于了解風味形成機制,為進一步探索優良發酵劑提供理論基礎。因此，本文對豆豉的揮發性成分和微生物多樣性變化以及兩者的相關關系研究進行綜述,旨在為以后提高豆豉品質、純種發酵以及工業化生產提供一定的理論指導。

1 微生物多樣性及其檢測技術

1.1 傳統培養方法

傳統培養方法是指對基質中的微生物體系利用培養基進行分離培養,獲得純種微生物的方法。該方法通常結合生理生化檢驗以及分子生物學等實驗確定菌種,從而獲得豆豉中的微生物多樣性信息[9]。

孫森[10]利用傳統培養方法對天然發酵豆豉后發酵期間的微生物進行分離培養,共純化出4株細菌、1株酵母菌和1株霉菌,并利用平板計數法分析菌相變化,確定了后發酵過程中的優勢菌分別為2株細菌(乳酸桿菌和芽孢桿菌)和1株酵母菌，細菌多樣性遠遠高于真菌多樣性。趙文鵬[11]利用傳統培養方法對曲霉型豆豉后發酵期間的微生物多樣性進行探究,結果也表明細菌多樣性遠大于真菌多樣性,且細菌及真菌多樣性整體呈下降趨勢,并從中分離純化出18種菌株,其中鑒定出的貝萊斯芽孢桿菌、雞葡萄球菌、咸海鮮魏斯氏菌被確定為后發酵期間的優勢菌。胡會萍等[12]同樣利用傳統培養方法對豆豉后發酵期間5個階段的微生物進行分離篩選,共純化出15株酵母菌、102株芽孢桿菌和69株乳酸菌。從中確定了6種優勢有益菌,并進行了分子生物學鑒定,該結果為未來豆豉的純種發酵提供了實踐基礎。

可見傳統培養方法在對豆豉發酵期間的微生物多樣性研究上,更側重于了解并確定優勢發酵微生物信息，同時具有簡便、鑒別較準確、能夠直接獲得發酵菌株的優點,成為目前常用的分析手段。然而該方法也具有自身的缺陷,比如可培養的微生物較少。據研究報道,利用傳統培養方法所了解的微生物信息甚至不到1%[13],因此在了解豆豉發酵期間的微生物多樣性上該方法局限性較大。

1.2 梯度凝膠電泳技術

梯度凝膠電泳技術是應用較早的現代非培養技術之一,目前最流行的有兩種,分別是變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE),前者應用較廣泛。依據的原理是不同菌種的DNA 分子堿基序列不同,其解鏈溫度亦不同。將提取的總DNA置于不同梯度的變性劑或不同溫度的電泳環境中,當其溫度達到某一DNA 片段的解鏈溫度時,立即開始部分解鏈,同時DNA 分子在電泳中的遷移速度隨著解鏈程度的增加而降低,因此不同的DNA 分子片段具有不同的遷移速度,在電泳中形成了互相分開的圖譜,實現了菌種的分離[14]。最后借助分子生物學方法對分離的條帶進行分析,即可獲得發酵微生物的信息。

曾濤等[15]利用DGGE技術研究了永川豆豉制曲和后發酵期間的菌群動態變化。研究結果表明在制曲階段占據主導地位的真菌為總狀毛霉，細菌為乳酸乳球菌,而在后發酵期間細菌的群落結構明顯復雜,曾在制曲階段出現的優勢微生物在后發酵期間急劇下降,甚至消失,同時出現了新的以枯草芽孢桿菌為主的優勢細菌。李小永[16]利用DGGE技術對細菌型豆豉后發酵期間的細菌多樣性進行研究,結果表明細菌多樣性呈現先升高后降低的趨勢,并推測出可能是營養物質及外環境的變化所致,并對分離出的15個條帶進行分析,得出主要優勢菌為多種不可培養細菌(UnculturedBacterium)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。而TGGE 技術在豆豉微生物多樣性方面未見報道。

因此,梯度凝膠電泳技術不需要進行傳統方法的培養就能檢測到不可培養的微生物,且具有檢測速度快、重現性強、可同時檢測到多種菌株的優點,是目前研究微生物演替規律、菌群動態變化的有力工具[17]。然而該技術也存在自身缺陷,一般只能分析少數的DNA分子片段(500 bp以下)[18], 因此得到系統進化的信息比較少,對微生物群落信息的了解有限。

1.3 限制性片段多態性技術

限制性片段多態性技術(RFLP)是指利用特定的限制性內切酶對DNA 序列進行酶切,由于不同菌種的DNA 序列不同,所以酶切位點會產生差異,酶切后會產生特征性長度不一的限制性片段,而每個長度不一的限制性片段代表一種菌株,對其進行分析,即可獲取微生物多樣性信息[19]。目前,以RFLP技術為基礎又發展出末端限制性片段多態性技術(T-RFLP)和擴增片段長度多態性技術(AFLP),其中的T-RFLP在豆豉微生物多樣性研究上應用較常見。如李小永利用T-RFLP技術對細菌型豆豉后發酵期間的微生物菌群進行分析,結果表明后發酵初期微生物多樣性指數較高,隨后降低,在中期升高,而后降低至末期的演替規律，確定了枯草芽孢桿菌和一些不可培養細菌為主要優勢菌。林榕姍[20]同樣利用T-RFLP技術對細菌型豆豉后發酵期間的微生物菌群動態變化進行了研究,并對酶切產物進行了測序掃描,結果顯示細菌多樣性指數、豐富度在后發酵期間整體較低且穩定,說明后發酵期間細菌種類并不多,優勢度分析得出后發酵前期優勢菌的含量較后期高。最后由數據庫鑒定可知,其中Firmicutes所占比例為80%,Bacillius所占比例為66.7%,優勢菌群特征比較明顯。

該技術具有重現性強、分辨率高以及可進行定性定量分析等優點,使得微生物多樣性和菌群演替規律研究得到了很大發展空間。但自身也存在著一些缺點,如進行定性時,數據庫不能夠進行精確匹配,無法明確鑒定菌種;同時DNA 濃度、限制性內切酶用量、酶切時間等因素都在一定程度上影響RFLP的準確性[21]，使得該技術無法準確全面地反映微生物多樣性信息。

1.4 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系的基礎上,引入熒光基團或熒光染料,通過熒光信號出現的順序以及強度進行實時監測PCR 全程,然后通過標準曲線對DNA 分子進行定性和定量的方法[22]。該方法具有簡單、快捷、靈敏度高、可同時測定大量樣品的特點,被廣泛用于食品致病菌檢測領域[23]。該技術在應用于發酵食品微生物多樣性上常需要借助特異性引物對菌群的豐度進行監測。如趙文鵬利用該技術結合特異性引物對豆豉發酵期間主要菌群的絕對豐度進行了測定,結果顯示細菌和真菌的絕對豐度呈逐漸下降的趨勢,且細菌的絕對豐度遠超真菌的絕對豐度,這為接下來主要微生物相對豐度的研究指明了方向。總的來說,該方法應用于豆豉微生物豐度及菌落組成的研究相對較少,其自身也存在一些缺陷,比如實驗影響因素多[24],且成本高、條件的設計和引物的選用較復雜,只能有少數序列進行分析,不能夠較全面反映微生物多樣性信息。

1.5 高通量測序技術

高通量測序(high throughput sequencing,HTS)又稱為下一代測序技術(next generation sequencing,NGS),該技術原理是對提取的總DNA 進行通用接頭拼接,之后進行PCR 擴增構建文庫,再對幾十萬至幾百萬條DNA 分子進行序列測定,同時獲取有效測序數據,并通過軟件和數據庫分析,最終獲得完整DNA 信息[25]。目前以Roche 454和Illumina測序平臺為主流應用。該技術具有高通量、耗時短、平行分析的優點,被廣泛應用于微生物菌群動態研究[26]。如Yang等利用高通量測序技術對豆豉發酵過程中的微生物多樣性和菌群演替進行了研究,結果顯示細菌多樣性在制曲階段不斷增加,在后發酵期間先降低而后逐漸升高,并推測出這是由細菌所處環境的變化而引起的，而真菌多樣性在制曲和后發酵期間都比較穩定，之后利用多元統計方法分析了微生物群落結構差異性，并從中揭示了在門和屬水平上優勢菌群的動態變化。Wang等[27]同樣利用該技術分析了不同類型豆豉(干豆豉和濕豆豉)的細菌群落多樣性,結果顯示濕豆豉的細菌多樣性和豐富度高于干豆豉,而干豆豉中的物種分布更加均勻，且不同類型豆豉菌落結構差異明顯。所有豆豉樣品共鑒定出9個門和192個屬,其中有5個優勢門和18個優勢菌屬,而芽孢桿菌可作為干豆豉的生物性標記物。目前來看,高通量測序技術在對部分低豐度及不可培養的微生物的鑒定方面,具有較其他方法更高的準確性,使其可快速、準確、全面地反映豆豉中微生物群落信息[28],正受到越來越多學者的關注。

2 揮發性成分及其檢測技術

2.1 GC-MS技術

氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術是目前用于檢測豆豉揮發性成分最常用的技術,該技術能夠對物質進行準確的定性定量分析,是探究豆豉揮發性成分信息的有力工具。通常GC-MS技術需要聯合一些前處理技術,比如固相微萃取技術(SPME)、攪拌棒吸附萃取技術(SBSE)、同時蒸餾萃取技術(SDE)、溶劑輔助風味蒸發技術(SAFE)等來實現對揮發性風味較為準確的捕捉。如Wang等[29]利用SDE-GC-MS技術對3種商業豆豉中的揮發性成分進行了探究,利用保留時間和數據庫進行定性,采用內標法進行定量。結果顯示,從3種商業豆豉中共檢測出131種揮發性化合物,其中共有的成分為25種,較為全面地表征了3種豆豉所含的揮發性成分。李金林等[30]利用SPME-GC-MS技術對曲霉型豆豉生產過程中的揮發性成分變化進行了研究,并進行定性定量分析。結果表明,各個階段揮發性成分分別為制曲24種、后發酵45種、干燥50種,揮發性成分主要在后發酵階段進行大量積聚和累積,且豆豉以醛類、酯類、醇類和酚類為主體成分,并發現干燥過程對豆豉的整體風味影響不大。然而該技術在對豆豉揮發性成分研究時,仍然存在一些不足,如檢測結果受前處理條件(萃取頭材料選用、萃取條件)、儀器設定條件影響較大,導致重現性差,同時存在GC進樣時間較長、效率不高、檢測限相對較高、對痕量揮發性成分的捕捉較為困難等問題[31]。

2.2 GC-O 技術

雖然GC-MS技術能夠對豆豉的揮發性成分進行較為準確的定性定量,但并不是所有的揮發性成分都對豆豉的香氣有貢獻作用,某些含量較低的揮發性成分反而具有較高的氣味強度[32]。因此，有必要探究這些能夠產生較強氣味的關鍵揮發性成分,以便于更好地了解豆豉的特征性風味。氣相-人工嗅聞(GC-O)技術就是利用人類的鼻子比現代儀器靈敏度更高的特點,去嗅聞豆豉中的關鍵活性香氣,確定豆豉中的主體香氣。該技術通常與GC-MS技術聯用來共同表征豆豉的揮發性成分。如 Chen等[33]利用GC-O/MS聯用技術對成品瀏陽豆豉的揮發性成分進行了檢測,結果顯示,GC-MS共檢測出55種揮發性成分,而GC-O 技術共嗅聞出29種氣味峰,其中有22種氣味峰被GCMS檢測到,根據嗅聞出的氣味強度明確了瀏陽豆豉的主體香氣物質為2-甲基丁醛、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、2,6-二甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、苯乙醛、苯乙醇、乙酸苯乙烯和丁酸苯乙酯。Wang等[34]同樣利用GC-O/MS技術對永川豆豉的揮發性成分進行了表征,結果顯示,利用GC-O 技術共嗅聞出51種氣味峰，其中49種被GC-MS技術鑒定出來，并利用GC-O 技術進行香味稀釋分析(AEDA),同時結合風味活性值(OAV)得到香氣活度較高的20種化合物。在后續實驗中對這20種揮發性成分進行了香氣重組和遺漏實驗,又從中篩選出10種化合物,并被認為是對豆豉主體香氣貢獻顯著的化合物。總的來說,該技術能夠彌補單一運用GC-MS技術所帶來的不足,是目前鑒定豆豉關鍵風味的有力工具[35]。

2.3 GC-IMS技術

氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)技術是根據不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異這一原理,來實現對不同基質中揮發性化合物進行檢測的一項技術[36]。不同于GC-MS技術,該技術具有檢測速度快、無需前處理、靈敏度高、更側重于對痕量揮發性成分捕捉的特點[37]。Chen等[38]利用GC-MS和GC-IMS兩種技術對瀏陽豆豉發酵過程中的揮發性成分變化分別進行了表征。結果顯示,GC-IMS技術檢測出80種揮發性化合物,其中明確鑒定出50種,包括12種醇類、12種醛類、9種酯類、9種酮類、3種酸類、3種吡嗪類、2種酚類,并對該技術所建立的指紋圖譜進行差異化分析,發現不同發酵時期揮發性成分差異較大,可通過揮發性成分變化進行明顯的區分。通過GC-MS共鑒定出81種不同的揮發性化合物,包括醇類14種、酯類13種、酸類7種、醛類6種、酮類5種、吡嗪類7種、酚類4種、其他25種。通過對比兩種技術發現,GC-IMS和GC-MS表現出不同的揮發性成分識別能力,GCMS對高濃度的吡嗪類更敏感,而GC-IMS對低濃度的醛類和酮類的敏感性更強。同時GC-MS 結果顯示,醇類是L1時期的主要揮發性有機物,而GC-IMS地形圖則顯示為醛類和酮類，可以看出兩種方法的化合物敏感性確實存在差異。GC-IMS技術由于對痕量物質的檢測較為準確,因此更側重于揮發性成分的差異化分析,在利用揮發性化合物差異區分不同發酵階段方面則顯得更有優勢。

2.4 電子鼻技術

電子鼻是一種新興的、可檢測分析基質中復雜揮發性成分的電子感官儀器。不同于GC-MS和GC-IMS,該技術不能對樣品中的揮發性成分進行定性定量檢測,只能分析出揮發性成分的整體信息[39],且該技術通常結合多元統計分析方法對樣品之間的氣味進行差異化分析。如蔣立文等[40]利用電子鼻技術對毛霉型豆豉發酵過程中的揮發性成分進行了檢測。結果顯示,隨著發酵時間的延長,10個傳感器的感應值明顯升高,說明隨著發酵的進行,揮發性成分在不斷地增加累積。結合主成分分析可以看出毛霉型豆豉前發酵與后發酵階段樣品氣味差異明顯,且后發酵樣品具有較多的共性成分。目前,該技術具有能夠極其快速檢測的特點,被廣泛應用于食品的真偽鑒別、質量抽檢等方面[41]。在表征揮發性成分變化上,單一運用該技術對豆豉揮發性成分分析較少,所以通常需要結合GC-MS等技術。

3 豆豉微生物多樣性與揮發性成分相關性分析

在研究豆豉發酵過程中微生物多樣性和揮發性成分的基礎上,進一步探索兩者之間的相關性成為近年來學者們研究的熱點話題。目前以皮爾遜、斯皮爾曼、偏最小二乘法為主要的分析方法。通過這些多元統計方法建立微生物菌群和風味代謝物之間的潛在關系。

Yang等利用雙向正交偏最小二乘法(O2PLS)建立了曲霉型豆豉細菌群落和風味的潛在關聯。結果顯示,Illumina MiSeq測序確定了發酵過程中的6個優勢屬,GC技術分析得到58種風味成分,O2PLS關聯分析表明,在|P|>0.8水平下,14個細菌屬對42種揮發性成分產生具有重要貢獻,它們分別是Ignatzschineria，Weissella，Corynebacterium_1，Lactococcus,Wohlfahrtiimonas，Atopostipes，Vagococcus，Peptostreptococcus，Tetragenococcus，Bacteroides,Kurthia, unclassified _f _Brucellaceae,Gulosibacter，norank _ f _Actinomycetaceae,并將這14個細菌屬確定為核心功能菌群。

Han等[42]利用斯皮爾曼相關分析對來自11個不同廠家的韓國大醬建立了微生物群落和代謝物之間的關系,結果顯示,在|R|>0.5,P<0.05水平下,3-甲基丁酸和四甲基吡嗪在部分樣品中含量較高,它們與兩個菌屬(Staphylococcus和Bacillus)呈顯著正相關,乙酸乙酯與3個菌屬(Weissella,Hyphopichia和Wickerhamomyces)呈顯著正相關,5種細菌屬與2種真菌屬都與4種以上的風味呈顯著相關性。因此,這些菌屬被視為與風味有關的重要菌屬。

Liu等[43]利用皮爾遜相關分析對郫縣蠶豆醬在發酵過程中的微生物群落及揮發性成分建立了關系。研究顯示,高通量測序技術確定了66個關鍵菌屬(平均相對豐度>0.1%),GC-MS技術鑒定出26種關鍵揮發性風味,皮爾遜相關性分析顯示,在|P|>0.6的水平下,有36個菌屬與揮發性化合物有密切的關系，并與其他風味代謝物進行了關聯,共確定了9種核心微生物，它們分別是Kosakonia,Kazachstania,Debaryomyces,Lactobacillus,Myroides,Stenotrophomonas,Ochrobactrum,Wohlfahrtiimonas和Lactococcus。這一研究對探索郫縣蠶豆醬的最佳發酵劑以及獨特風味的形成機制提供了理論基礎。然而目前對豆豉的關鍵菌屬和代謝物進行關聯分析的相關報道還比較少,這將會成為進一步研究的熱點。

4 總結及展望

豆豉因具有豐富的功能活性物質和獨特的口味成為目前廣大學者研究和開發的熱點。發酵菌種、生產工藝、發酵條件等都會影響豆豉的最終質量,許多豆豉生產廠家仍然停留在傳統工藝制作上,依舊存在豆豉質量參差不齊、發酵周期長等制約企業發展的技術難題,因此亟需研發優良發酵劑,優化生產工藝,在保持原有風味的前提下,實現工業化、標準化生產。

利用先進的技術對豆豉進行微生物群落演替與代謝物成分相關性研究,是目前探索優良微生物資源、風味形成機制的基本研究,也為未來發酵菌種篩選與純種發酵、工藝優化提供了基本理論。此后應繼續加大對豆豉發酵菌種的研究,進一步使豆豉生產產業化、標準化，讓我國的傳統食品豆豉可以走出國門,進一步激發市場潛力。