非洲豬瘟疫苗研究進展

鄧 昊，王 濤，趙建軍*

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江 哈爾濱）

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是一種急性、高度傳染性和致死性疫病。世界動物衛生組織（World Organization for Animal Health,OIE）規定ASF 為必須上報的動物疫病，被我國列為一類動物傳染病[1]。1921 年，肯尼亞首次發現ASFV，其之后在非洲持續流行，最終影響多達35 個非洲國家。20 世紀50 年代末到80 年代初，ASFV 在歐洲、俄羅斯、加勒比海和南美洲相繼出現[2]。2018 年8 月，ASFV 首次傳入我國遼寧省沈陽市[3]。ASFV 是非洲豬瘟相關病毒科（Asfarviridae）的唯一成員，含有囊膜包裹的二十面體結構，是一種脫氧核糖核酸病毒，也是唯一已知的蟲媒DNA 病毒[4]。病毒粒子具有5 層結構，從外向內依次為囊膜、衣殼、內膜、核心殼和基因組[5]，基因組全長170~194 kb，編碼150~200 種病毒蛋白，包括68 種結構蛋白和100多種非結構蛋白[1]。

近一個世紀以來，盡管科研人員通過多種途徑創制ASF 疫苗，但研究表明，滅活疫苗不能提供免疫保護，亞單位疫苗、活載體疫苗和DNA疫苗只能提供部分的免疫保護。而減毒活疫苗（Live-attenuated vaccines, LAVs）中的基因缺失疫苗是目前最有效的方案，越南通過該途徑，在近日宣布成為世界首位發布ASF 商品化疫苗（ ASFV-G-?I177L 為 疫 苗 株） 的 國 家（https://en.vietnamplus.vn），說明基因缺失疫苗有望成為“黑暗里的曙光”。

1 滅活疫苗

滅活疫苗主要通過物理（紫外線、高溫、低溫、高壓等）、化學（苯酚、福爾馬林、乙烯亞胺、焦碳酸二乙酯等）或兩者相結合的方式使病原體失活。由于其生產工藝簡單且安全，被廣泛應用于疾病防控[6]。Cadenas-Fernández E 等[7]將滅活的ASFV 與新型佐劑（MF59?、Silica oil、mGNE、MontanideTMISA201）進行配伍，對豬采用皮內和肌肉同時注射高劑量（6×109HAD50）的滅活疫苗，接種后豬群健康狀況正常。不幸的是，經強毒攻毒后，均出現與ASF 相似的臨床癥狀，并發現存在疫苗接種豬臨床反應滯后，因此，關于滅活疫苗抗體依賴性增強效應（ADE）的推測[8]，還有待進一步驗證。ASF 滅活疫苗不能提供保護性免疫，這可能與滅活疫苗誘導的免疫應答有關。同時，也可能與ASFV 不同的感染性顆粒有關。

2 減毒活疫苗

2.1 自然弱毒疫苗株

篩選自然弱毒株是創制疫苗過程中常用的方法，其廣泛應用于動物傳染病的預防。Gallardo C 等[9]在2017 年從野豬體內分離得到non-HAD特性的自然弱毒株（Lv17/WB/Rie1），免疫后，部分豬呈現亞臨床癥狀，低病毒血癥等。之后免疫豬與病毒感染豬同群飼養。結果發現，疫苗接種豬無一例死亡。自然弱毒疫苗在誘發免疫保護的同時，也會使部分豬出現非特異性的反應，包括瘀點、壞死灶、關節腫脹和肺炎等[10]。因此，解決自然弱毒疫苗的殘余毒力，是未來急需解決的問題。

2.2 細胞傳代培養弱毒疫苗株

上個世紀60 年代至90 年代，ASF 在西班牙和葡萄牙流行期間，研究人員成功分離ASFV 野毒株，經細胞傳代培養后，其致病性減弱[10]。最近，研究學者將ASFV-G-?I177L 疫苗株[11]經細胞傳代后，獲得其衍生毒株（ASFV-G-?I177L/?LVR）。動物感染實驗表明，ASFV-G-?I177L/?LVR 和ASFV-G-?I177L 一樣對豬只無致病性，并具有免疫原性和保護作用[12]。雖然細胞傳代致弱ASFV 是一種可行的方法，同時早期ASFV 弱毒株的研制主要通過細胞傳代，如 BA71v，E75CV1 等，但增加傳代次數會導致ASFV 免疫原性降低，難以提供對親本毒株的攻毒保護，因而很難找到準確的傳代次數進行后續動物試驗，具有一定的盲目性和隨機性[13]。因此，就目前而言，采用細胞傳代技術創制ASF 弱毒疫苗不是最理想的方式。

2.3 基因缺失弱毒疫苗株

相比于自然篩選和細胞傳代技術，目前最前沿和最主要的方法是采用反向遺傳操作，將親本強毒株毒力相關基因敲除，制備弱毒疫苗株（表1）。最新基因缺失活疫苗研究發現，對基因Ⅱ型同源強毒株（HLJ/18、ASFV-G、SY18）的攻毒保護能達到100 %[11,14-17]，而對基因Ⅰ型同源弱毒株（BA71?CD2）和強毒株（Congo-a）卻無法提供保護作用[18-19]。我國學者合成的HLJ/18-7GD（缺失7 個毒力相關基因）疫苗株對商品豬，妊娠母豬都能提供較強的保護作用，疫苗持續周期長，能保障商品豬順利出欄，且不會造成母豬流產以及影響仔豬的生長發育[17]，是目前最有潛力的ASF 疫苗。Borca M V 等[11]利用反向遺傳操作技術，敲除ASFV（ASFV-G 株）I177L 基因，從而構建的ASFV-G-?I177L 弱毒株對親代ASFV 攻毒具有良好的保護作用。經抗體檢測發現，口鼻接種或肌肉接種產生的由IgG1、IgG2和IgM 介導的特異性抗體反應并沒有差異。然而ASFV-G-?I177L 和HLJ/18-7GD 并未涉及異源強毒株的攻毒實驗，因此，上述疫苗株是否具有交叉保護作用還需要進行臨床實驗評估。Koltsova G 等[19]將Congo-a（一種適應細胞培養的衍生毒株）缺失 CD2v（EP402R）基因所構建的?CongoCD2v 弱毒株，對豬群進行疫苗接種實驗。結果顯示，所有豬群經Congo-v 強毒株攻毒后，無一幸存。相反，用Congo-a 免疫豬群后，以同樣的方法進行攻毒實驗，豬群存活率為100 %。研究人員推斷CD2v 是一種能誘發機體對同源毒株產生免疫保護的重要抗原[19]?；谝陨涎芯勘砻?，疫苗的交叉保護性和病毒關鍵毒力基因的鑒定是決定著基因缺失活疫苗發展的關鍵因素，值得深入研究。

表1 基于親本ASF 毒株基因缺失活疫苗的最新研究進展

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗和活載體疫苗

ASF 亞單位疫苗的研發主要集中于ASFV 保護性抗原或抗原表位[20]。Lopera-Madrid J 等[21]首次在HEK 細胞中表達p72、p54 和p12 蛋白，進行初次免疫和加強免疫。結果發現，豬血清中含有特異性的抗體。接著用改良痘病毒（MVA）表達的B646L，EP153R 和EP402R 蛋白進行初次免疫和加強免疫，以及用MVA 表達的蛋白進行初免，HEK 細胞表達的蛋白進行加強免疫，兩種方法均在血清中檢測到特異性的抗體，且混合免疫的豬產生了特異性的T 細胞。上述研究停留在免疫應答，缺乏ASFV 強毒株的攻毒實驗。亞單位疫苗同滅活疫苗一樣，具有很高的安全性，但缺少對ASFV 保護性抗原的認知，以及如何誘導機體產生免疫保護的機制尚未闡明，從而制約了ASF 亞單位疫苗的發展。

活載體疫苗是將目的基因克隆到病毒基因組中，從而實現對目的蛋白的表達。相應的表達載體有腺病毒和改良痘病毒（MVA）等。Goatley L C 等[22]將B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 基因克隆到腺病毒載體上，并進行初次免疫，同樣的基因亞克隆到MVA 載體作為加強免疫。首次免疫59d 后進行攻毒實驗，結果表明，免疫豬群的存活率為100 %。為了探究那種抗原能夠誘導豬產生有效的細胞免疫，研究人員利用ELIspot 從133 種ASFV 蛋白中篩選出18 種蛋白，分別將其基因克隆到腺病毒和MVA，并進行免疫實驗。研究表明，表達上述蛋白的病毒載體并不能使豬免受ASFV 強毒株的攻擊[23]。ASFV 保護性抗原的鑒定是活載體疫苗成功的關鍵之一。同時，深入探究病毒抗原之間的相互作用，有利于發現新的免疫策略。

3.2 DNA 疫苗

DNA 疫苗是將病原體的基因片段克隆到表達載體上，通過在機體內表達目的蛋白，從而達到免疫的效果。目前較多的研究表明，DNA 疫苗能夠引起豬強烈的細胞介導的細胞毒性T 淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）應答[23-24]。近期，國外學者將ASFV 的M488R 和MGF505-7R 基因克隆到pCMV 載體上，并與泛素相融合，構建了新型質粒（pCMV-Ub-M448R、pCM V-Ub-MGF505-7R）。兩種質?；旌铣醮蚊庖哓i，用BA71?CD2 弱毒疫苗進行加強免疫。在攻毒實驗中，DNA 疫苗的初次免疫增強了BA71?CD2作為加強疫苗的保護作用。隨后研究人員通過ELIspot，證實M488R 和MGF505-7R 兩種蛋白是具有保護作用的T 細胞表位[24]。說明T 細胞作為機體適應性免疫的成員，在抵抗ASFV 中充當著重要的角色。因此，還應進一步探究ASFV 誘導細胞免疫的機制。

4 小結與展望

ASF 在我國雖已得到有效控制，但其危害性仍然存在且不可忽略，研發安全有效的ASF 疫苗依舊是當下亟需解決的問題?，F有部分疫苗已在臨床實驗中表現出良好的保護作用，如我國研制的 HLJ/18-7GD 疫苗，口鼻免疫的 ASFV-G-?I177L 疫苗等，但基因缺失疫苗的交叉保護性還有待進一步驗證。眾多活載體疫苗、亞單位疫苗和DNA 疫苗項目并未進行病毒攻毒實驗，即使在豬群體內產生了特異性的抗體或T 細胞，但其是否有效，還需要進一步臨床實驗驗證。對于滅活疫苗，研究表明，無法提供有效保護。

未來，應加強病毒與宿主相互作用以及復制過程中相關基因的研究。同時，利用好生物信息技術，對ASFV 潛在的靶點進行篩選和評估，通過體外實驗和構建動物模型來論證靶點的有效性。除此之外，還需積極探究ASFV 相關蛋白抑制宿主免疫應答的機制，深入挖掘體液免疫和細胞免疫在對抗ASFV 感染時所扮演的“角色”，探索新的疫苗類型（mRNA 疫苗）等。隨著對ASFV 結構深入的解析，闡明與機體相互作用的方式，以及相關新產品新技術的支持等，期待能夠使ASF 疫苗實現新的突破。