一例疑似由禽白血病引起蛋雞腫瘤的診斷

武世珍，靖吉強，李 舫，張興娟

（山東畜牧獸醫職業學院 山東 濰坊 261061）

近幾年，蛋雞養殖快速發展，養殖條件不斷改善，但在淘汰蛋雞屠宰檢疫過程中，常發現蛋雞十二指腸及附近組織出現白色腫瘤樣病變，造成雞胴體廢棄，有些雞群胴體廢棄率達2 % 以上，給蛋雞養殖造成嚴重的危害。筆者對發病雞群進行了病因調查和防控措施的探討。

1 發病雞群調查

發病雞群中大部分雞精神、食欲正常，每天的產蛋量相對穩定，但穩中有降。少部分雞精神沉郁并逐漸加重，體重漸進性減輕，產蛋減少且蛋殼質量變差，嚴重時停止產蛋。剖檢病雞，有時見胸肌萎縮，血液稀薄。剪開腹壁，十二指腸、胰腺、腺胃壁、腸系膜、輸卵管壁、腹壁均見腫瘤（圖1、圖2），但肝臟、脾臟大小基本正常。腫瘤有不斷向周圍組織蔓延的趨勢。病雞氣管、食道、心臟、腎臟、卵巢未見異常。雞群發病率在4 %~10 %，病死率和發病率相當。頭孢類抗生素治療無效果。

圖2 病雞胰腺、腹膜出現腫瘤

2 實驗室診斷

2.1 病理學診斷

用鋒利手術刀一次性切下十二指腸上的腫瘤組織，修成2mm×2mm×3mm 的小組織塊，用10 % 福爾馬林固定，脫水透明，浸蠟、包埋，切片、貼片，蘇木精-伊紅染色，封片，用顯微鏡觀察。

2.2 RT-PCR 檢測禽白血病病毒

2.2.1 引物合成參考 DB21?T1889—2001《禽白血病診斷技術規程》合成下列引物：F:AAGTAA GGTGGTACGATCTG，R: CTGCTTCATTCAGGT GTTCGCAAT，該特異性引物擴增的目的基因是禽白血病病毒LTR 序列，擴增片段為220 bp。

2.2.2 核酸提取 利用北京索萊寶科技有限公司的總RNA 提取試劑盒提取核酸，主要步驟是：取100 mg 腫瘤組織加1 ml 裂解液，用勻漿器勻漿，室溫放置5 min，向勻漿液體中加0.2 ml 氯仿，振蕩 0.5 min，25 ℃ 放置 5 min。4 ℃12 000 rpm 離心10 min，把水相轉移到新離心管中。收集的液體中加入200 μl 無水乙醇混勻，然后加入經前處理后的吸附柱靜置 2 min，4 ℃12 000 rpm 離心2 min，棄廢液。向吸附柱中加入600 μl 漂洗液，4 ℃ 12 000 rpm 離心2 min，棄廢液。漂洗2 次后，12 000 rpm 離心2 min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫放置10 min，然后將吸附柱放入新離心管中，向柱中央滴加100 μl 無 RNA 酶 水， 室 溫 放 置 5 min ，12 000 rpm 離心2 min 即得到RNA。

2.2.3 RT-PCR 檢測 利用北京索萊寶科技有限公司的通用RT-PCR 試劑盒，在42 ℃ 反應1h，取2 μl 作為模板進行PCR 反應。PCR 反應條件：95 ℃ 1 min；94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min；72 ℃ 0.5 min；35 個循環，72 ℃ 10 min。

3 結果

3.1 病理切片觀察

淋巴母細胞樣瘤細胞形態大小較一致，腫瘤病灶聚集性生長（圖3），形成瘤細胞集中區域，擠壓周圍組織。

圖3 淋巴母細胞樣瘤細胞聚集性生長（HE 染色1000 倍）

3.2 RT-PCR 檢測禽白血病病毒結果

取5 μl PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，取出凝膠板置于凝膠成像儀進行觀察。擴增出了220bp 目標片段（圖4）。將PCR 產物送上海生工進行測序。將所得序列在NCBI 數據庫進行比對，比對結果表明，該序列與禽白血病病毒的核酸同源性在98 %～100 %（圖5）。說明該病例存在禽白血病的感染。從系統進化樹可看出：本病例中禽白血病病毒與在美國禽白血病病毒分離株核酸同源性最近，與湖北、廣東分離到的禽白血病病毒核酸同源性稍遠，同2021 年比利時從肉雞體內分離的禽白血病病毒的核酸同源性最遠（圖6）。由此可推測，禽白血病病毒在不同地區的傳播可能與引進種雞、雞產品交易等有關。對疑似病雞進行及時檢測，對于控制該病具有重要意義。

圖4 禽白血病病毒目的片段電泳結果

圖5 核酸比對結果

圖6 系統進化樹

3.3 診斷結論

根據這種蛋雞腫瘤病的流行特點、癥狀、病變，結合實驗室檢測，可初步診斷為禽白血病病毒感染。對發病蛋雞場采取禽白血病凈化、消毒等綜合措施，病情得到了控制。由于禽白血病病毒不斷變異，深入研究蛋雞近年來十二指腸及其附近組織頻繁出現白色腫瘤的深層原因是十分必要的。

4 討論

4.1 檢測、凈化蛋種雞群，生產無禽白血病的蛋雞苗

禽白血病的流行，給蛋雞生產造成了嚴重經濟損失[1]。實行全進全出制，阻斷垂直傳播，是控制該病的重要措施。蛋種雞場不從禽白血病陽性雞場引入種雞、種蛋。引入的種雞應先隔離飼養，檢測白血病抗體，并關注臨床表現，堅決淘汰陽性雞。蛋種雞開產后，定期檢測雞群血清中A、B 或J 亞群 ALV 抗體水平，一旦異常，及時采取撲滅措施。

4.2 雞場強化生物安全措施

把好疫苗關，選擇正規廠家的疫苗。杜絕使用被外源性 ALV 污染的弱毒疫苗、卵黃液或其他生物制品。注射疫苗時，要及時更換針頭。種蛋應及時收集，熏蒸消毒，孵化場，育雛室嚴格消毒，減少早期感染。雞場要遠離家禽屠宰場、化工廠、交通要道、村莊等。雞場內布局要合理，辦公區、生產區、糞污處理區要分開。生產區內臟道和污道分開，注意防鳥滅鼠。雞場門口設消毒池，生產人員更衣、換鞋、淋浴后才能進入雞舍。設立遠程觀察系統和報警裝置，減少人員進雞舍的次數。禁止無關人員進入雞舍。

4.3 建立優良公雞精液站

ALV 感染雞可導致腫瘤發生和免疫抑制[2]，因此定期對公雞進行禽白血病健康檢查，確保公雞精液不攜帶外源性 ALV 具有重要經濟意義。建立優良公雞精液站，推廣人工授精，減少因精液污染外源性 ALV 而造成的疫情擴散。人工授精時注意輸精器械的消毒，減少人為傳播。

4.4 建立純種雞保護制度

增加純種雞保護經費的投入，優化各種生物安全措施，定期檢測禽白血病。加強禽白血病的實驗室快速監測方法的研究，特別是分子生物學診斷[3]和抗體檢測方面，進一步降低禽白血病檢測成本和提高準確率。加強育種工作，利用基因編輯技術培育抗白血病的蛋雞新品種。