禽白血病凈化中胎糞檢測方法的研究

陳小嬌，張 妹，陳文平

（北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206）

禽白血病是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科中禽反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員—禽白血病/肉瘤病毒群病毒（ALV/RSV）引起的禽類各種可傳播的良性和惡性腫瘤[1]。ALV 感染在生產(chǎn)中引起的損失主要體現(xiàn)在兩方面，一方面是產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞只直接死亡；另一方面是產(chǎn)生非腫瘤綜合征，主要表現(xiàn)為生產(chǎn)指標(biāo)發(fā)生變化，如性成熟推遲、母雞產(chǎn)蛋率下降、蛋重下降、受精率下降和孵化率下降等。ALV 傳播方式主要有兩種，一種是由母雞傳給子代雞，即為垂直傳播。母雞感染病毒后，病毒在輸卵管的膨大部進行大量復(fù)制，隨之感染種蛋。大量病毒在感染胚胎的胰腺積聚，并從剛出殼雛雞的糞便中排出，具有很強的傳染性[2]。另一種是感染雞與健康雞之間的直接或間接接觸而傳播，即為水平傳播[3]。雞只之間的水平傳播主要發(fā)生在孵化期間和出雛后的前2 周內(nèi)，尤其是雛雞出殼后48 h 內(nèi)，具有很強的傳播性，因此胎糞檢測是禽白血病凈化程序的“重中之重”。針對規(guī)模化養(yǎng)殖場1 日齡雛雞數(shù)量多、禽白血病凈化檢測任務(wù)重和檢測時間緊迫等問題，亟需建立一套快速、有效、準(zhǔn)確的胎糞檢測方法。本研究對1日齡雛雞胎糞ALV 檢測方法進行優(yōu)化，建立一套適合規(guī)模化養(yǎng)禽場的胎糞ALV 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）父母代京紅1 號的1 日齡雛雞胎糞樣品。（2）主要試劑盒和儀器：ALV p27 抗原ELISA 檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司；酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；洗板機購自美國伯騰儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 按照IDEXX 公司的ALV p27抗原ELISA 檢測試劑盒說明書規(guī)定的方法檢測。

1.2.2 試驗分組 （1）未凍融與凍融檢測對檢測結(jié)果的影響。取90 份1 日齡雛雞胎糞樣品，將每一份樣品均分為 3 等份，分別對應(yīng)未凍融、-196 ℃ 液氮凍融、-20 ℃ 冰箱凍融3 個組，研究胎糞樣品未凍融與凍融對檢測結(jié)果的影響及液氮或冰箱凍融對實驗結(jié)果的影響。（2）不同凍融溫度對檢測結(jié)果的影響。取90 份1 日齡雛雞胎糞樣品，將樣品顛倒數(shù)次混合均勻后編號，將每一份樣品平均分成2 個等份，分別經(jīng)過液氮凍融和冰箱凍融后進行檢測，研究液氮與冰箱凍融后對檢測結(jié)果的影響。（3）胎糞不加稀釋液與加入稀釋液對檢測結(jié)果的影響。取270 份1 日齡雛雞胎糞樣品編號，冷凍后對270 份樣品進行檢測，將其中1~90 號樣品加0.5 ml 稀釋液后再檢測，1’~90’號樣品加0.5 ml 稀釋液后再次冷凍，1”~90”號樣品不加稀釋液再次冷凍，解凍后將1’~90’號和1”~90”樣品再次進行檢測，研究稀釋液量及加入時間對檢測結(jié)果的影響。（4）多個樣品混合對檢測結(jié)果的影響。取40 份1 日齡雛雞胎糞樣品編號，凍融后進行一次檢測，之后將每兩份胎糞樣品進行混合，充分搖勻混合后取上清再次檢測，研究多個樣品混勻?qū)z測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 未凍融與凍融對檢測結(jié)果的影響

胎糞樣品經(jīng)冰箱與液氮凍融后均比未凍融的樣品陽性率高。結(jié)果見表1。

表1 胎糞未凍融與凍融后檢測ALV p27 抗原結(jié)果

2.2 不同溫度凍融樣品對檢測結(jié)果的影響

胎糞樣品 -20 ℃ 冰箱凍融與 -196 ℃ 液氮凍融檢測的陽性率差異不顯著。結(jié)果見表2。

表2 不同溫度凍融樣品對檢測結(jié)果的影響

2.3 胎糞不加稀釋液與加入稀釋液對檢測結(jié)果的影響

在凍融之后加稀釋液再進行檢測，檢測陽性率有所下降，靈敏度降低。在凍融之前不加稀釋液和加稀釋液對檢測結(jié)果沒有影響。結(jié)果見表3。

表3 胎糞不加稀釋液與加入稀釋液檢測ALV p27 抗原結(jié)果

2.4 胎糞單樣與混樣檢測對檢測結(jié)果的影響

胎糞單樣與混樣檢測結(jié)果存在差異，多份胎糞混樣會影響樣品的檢出率，會有假陽或假陰性的產(chǎn)生。胎糞單樣與混樣檢測ALV p27 抗原，結(jié)果見表4。

表4 胎糞單樣與混樣檢測ALV p27 抗原結(jié)果

3 討論

試驗表明，采集胎糞樣品時加入0.5 ml 稀釋液，對檢測結(jié)果無明顯影響，加入稀釋液能夠增加樣品上清液的量，不僅能夠提升加樣速度，而且能夠避免加樣時吸入沉渣，避免堵塞洗板機。稀釋后的待檢胎糞樣品便于上清液的吸取，且雜質(zhì)含量減少，在檢測過程中易于清洗，不會影響后續(xù)實驗步驟，確保檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。胎糞樣品凍融有助于胎糞中的P27 蛋白游離出來，提高對P27 的檢出率，為縮短凍融時間，減少出殼雛雞上架之前的存放時間，減少雞群應(yīng)激，胎糞樣品應(yīng)采用液氮方式凍融。同時，胎糞陽性樣品混合后檢測結(jié)果變?yōu)殛幮裕瑫斐陕z情況；同時也會導(dǎo)致陰性樣品檢測結(jié)果變?yōu)殛栃裕嬖诩訇栃缘膯栴}，因此胎糞檢測需進行單只采集，逐只普測，避免多個雛雞胎糞樣品混合后檢測會有假陽性或假陰性的產(chǎn)生，從而影響凈化效果。

禽白血病的傳播方式主要以垂直傳播為主，各代次呈現(xiàn)逐級放大的效應(yīng)，嚴(yán)重影響雛雞質(zhì)量[4]。禽白血病凈化是行業(yè)健康發(fā)展的需求，需要將禽白血病消滅在種源環(huán)節(jié)，切斷垂直傳播途徑，從而保證種源健康。禽白血病的水平傳播主要發(fā)生在孵化期間和出雛后的前2 周內(nèi)，而孵化環(huán)節(jié)是雛雞孵育的第一個環(huán)節(jié)，也是最重要的環(huán)節(jié)。根據(jù)禽白血病的傳播特點，1 日齡雛雞胎糞檢測是凈化程序的關(guān)鍵，是建立陰性雞群的第一步，對做好禽白血病凈化工作起著至關(guān)重要的作用。通過總結(jié)多個批次胎糞檢測工作，完善雛雞胎糞檢測的每一個環(huán)節(jié)，選擇快速且適合胎糞檢測的方法，各個關(guān)鍵點的嚴(yán)格控制保證實驗檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，避免家系間的交叉感染等多方面措施來保證雛雞檢測工作順利運行，有效地控制ALV傳播。