ANIT誘導亞急性肝內膽汁淤積大鼠模型肝臟氧化應激水平及膽汁酸受體表達的變化

姚嘉明 陳芝蕓 陳曦 劉彬彬 葉蔚 王小奇 張潔

肝內膽汁淤積是由于多種原因引發膽汁的形成、分泌和（或）排泄異常，肝內膽汁酸和其他有毒化合物蓄積從而導致肝組織損傷的病理狀態，臨床上較常見。目前認為，氧化應激及膽汁酸代謝障礙與該病發病密切相關。使用異硫氰酸萘酯（ANIT）一次性灌胃是多年來國內外公認的大鼠急性肝內膽汁淤積實驗模型，其肝功能及病理變化與人類相似，被用于各類機制研究及藥效驗證。但該模型發病過程為自限性，高峰在用藥后48 h，較難應用于亞急性及慢性肝內膽汁淤積以及相關肝纖維化的研究。歐巧群等［1］報道采用低劑量ANIT間歇重復給藥的方法成功建立大鼠亞急性肝內膽汁淤積新模型，作者采用該法亦成功建立該模型，并進一步分析肝臟氧化應激水平及膽汁酸受體表達的變化，以期為該模型的擴大應用及藥物研究提供理論及實驗依據。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠48只，SPF級，體重130～150 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016，在浙江中醫藥大學實驗動物中心適應性飼養1周后開始實驗。實驗時間2016年1月至2018年12月。

1.2 主要試劑 ANIT由北京百靈威科技有限公司提供。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）、SYBR? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）由寶生物工程（大連）有限公司提供；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 分組及處理 48只SD大鼠隨機分成正常組及模型組，各24只。模型組于第1天灌服1.6%ANIT（麻油配制）80 mg/kg，正常組以等量麻油灌胃，1次/周，連續4次，分別在第9、16、23天每組各處理大鼠8只。各大鼠于處理前晚禁食不禁水，次日上午空腹麻醉下腹腔靜脈取血，分離血清檢測肝功能；分離肝組織，部分在10%中性甲醛中固定行病理觀察，其余肝組織存入-80℃待用。

1.4 檢測方法 采用全自動生化檢測儀檢測血清總膽紅素（TB）、總膽汁酸（TBA）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）水平。采用HE染色光鏡觀察肝組織炎癥、膽汁淤積情況。采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定肝組織SOD活力，硫代巴比妥酸（TBA）法測定肝組織MDA含量，比色法測定肝組織GSH-PX和CAT活力；肝組織勻漿蛋白定量采用BCA法。采用熒光定量PCR法檢測肝組織核因子NF-E2相關因子（Nrf2）、SOD1、SOD2、SOD3、CAT、法尼醇受體（FXR）、鈉離子-?；悄懰釁f同轉運蛋白（Ntcp）、膽鹽輸出泵（Bsep）、多耐藥相關蛋白2（Mrp2）、多耐藥相關蛋白3（Mrp3）基因mRNA表達。以β-actin作為內參，用相對表達量（2-△△Ct）衡量目的基因表達水平。

1.5 統計學分析 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清肝功能水平 第9、16、23 天，模型組ALT、AST、ALP、GGT、TBA、TBIL、DBIL、ALB與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見表1～3。

表1 第9天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

表1 第9天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 n ALT（IU/L） AST（IU/L） ALP（IU/L） GGT（IU/L） TBA（μmol/L）TBIL（μmol/L）DBIL（μmol/L） TP（g/L） ALB（g/L）正常組 8 50.62±8.53 156.50±21.32 227.50±61.02 1.25±0.46 25.27±27.36 1.30±0.32 0.67±0.28 50.88±2.25 29.86±0.80模型組 8 423.37±120.99*759.50±211.63* 972.50±94.61* 11.87±3.83* 659.55±143.91* 127.01±24.93* 107.67±20.82* 52.81±1.51 26.00±0.74*

2.2 各組大鼠病理組織學變化 正常組肝組織構造完整，肝細胞排布有序，無炎性滲出或膽管增生。模型組第9 天時見肝小葉構造被破壞，細胞腫脹，膽管四周的部位更顯著，見點狀和灶性壞死區，匯管區見炎癥細胞浸潤，膽管增生，細胞壞死脫落，部分膽管上皮細胞內見膽栓；第16 天模型組肝小葉構造被破壞、炎癥反應及膽管增生仍顯著；第23 天模型組肝臟構造部分顯示不清，有顯著的炎性細胞滲出及膽管增生。見圖1。

表2 第16天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

表2 第16天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 n ALT（IU/L） AST（IU/L） ALP（IU/L） GGT（IU/L） TBA（μmol/L）TBIL（μmol/L）DBIL（μmol/L） TP（g/L） ALB（g/L）正常組 8 36.62±4.68 161.75±22.48 193.50±58.57 0.62±0.51 29.72±38.79 1.18±0.59 0.85±0.45 54.57±2.99 30.40±1.76模型組 8 399.12±51.07* 726.00±147.23* 910.25±68.35* 10.87±3.64* 441.62±89.01* 123.67±21.95* 105.76±19.51* 54.66±1.73 26.21±0.78*

表3 第23天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

表3 第23天兩組大鼠血清肝功能水平的變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 n ALT（IU/L） AST（IU/L） ALP（IU/L） GGT（IU/L） TBA（μmol/L）TBIL（μmol/L）DBIL（μmol/L） TP（g/L） ALB（g/L）正常組 8 37.88±4.13 147.11±15.34 150.22±35.67 0.55±0.52 12.12±5.12 0.96±0.44 0.84±0.32 57.40±2.11 31.32±0.90模型組 8 647.55±108.82*976.87±201.85* 1,051±186.77* 11.37±2.32* 640.98±257.98* 121.07±37.64* 99.65±29.68* 57.52±2.72 27.18±1.06*

圖1 亞急性膽汁淤積大鼠肝組織病理組織學變化（HE×100）

2.3 各組大鼠肝臟氧化應激水平 第9、16、23天模型組大鼠肝臟MDA含量均比正常組升高（P＜0.01），而SOD、GSH-Px、CAT的活性比正常組明顯降低（P＜0.01），見表4～6。

表4 第9天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

表4 第9天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 MDA（nmol/mgprot）SOD（U/ mgprot）GSH-PX（U/ mgprot）CAT（U/ mgprot）正常組 1.27±0.39 136.77±26.75 58.75±8.32 41.38±3.68模型組 2.65±0.52* 75.02±16.41* 31.72±9.41* 18.03±5.43*

表5 第16天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

表5 第16天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 MDA（nmol/mgprot）SOD（U/ mgprot）GSH-PX（U/ mgprot）CAT（U/ mgprot）正常組 1.28±0.29 149.20±32.83 55.76±15.74 36.19±9.26模型組 3.24±0.35* 73.96±13.11* 26.05±8.71* 16.17±5.38*

表6 第23天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

表6 第23天兩組大鼠肝組織氧化應激指標的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 MDA（nmol/mgprot）SOD（U/ mgprot）GSH-PX（U/ mgprot）CAT（U/ mgprot）正常組 1.03±0.23 128.48±27.42 56.28±12.68 39.00±9.87模型組 3.40±0.74* 75.25±11.04* 26.77±7.78* 19.36±5.61*

2.4 各組大鼠肝臟氧化應激和膽汁酸受體相關基因mRNA的表達 第9、16、23天，模型組大鼠肝組織CAT、SOD1、SOD2、SOD3、FXR、Ntcp、Bsep、Mrp2 mRNA表達比正常組明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），Mrp3 mRNA比正常組明顯增加（P＜0.01）；第16、23天模型組大鼠肝組織Nrf2 mRNA表達較正常組明顯下降（P＜0.01）。見表7～9。

表7 第9天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

表7 第9天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 FXR mRNA Ntcp mRNA Besp mRNA Mrp2 mRNA Mrp3 mRNA Nrf2 mRNA CAT mRNA SOD1 mRNA SOD2 mRNA SOD3 mRNA正常組 1.09±0.40 1.00±0.08 1.20±0.67 1.05±0.32 1.04±0.31 1.02±0.23 1.03±0.28 1.01±0.19 1.03±0.28 1.13±0.50模型組 0.33±0.18* 0.33±0.15* 0.42±0.13* 0.50±0.15* 2.01±0.46* 0.81±0.21 0.41±0.15* 0.41±0.11* 0.41±0.06* 0.25±0.08*

表8 第16天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

表8 第16天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

組別 FXRmRNA Ntcp mRNA Besp mRNA Mrp2 mRNA Mrp3 mRNA Nrf2mRNA CAT mRNA SOD1 mRNA SOD2 mRNA SOD3 mRNA正常組 1.04±0.31 1.11±0.22 1.24±0.96 1.06±0.41 1.21±0.89 1.04±0.30 1.02±0.24 1.04±0.31 1.02±0.22 1.03±0.29模型組 0.16±0.05** 0.18±0.06** 0.28±0.08* 0.38±0.13** 2.59±0.53** 0.53±0.13** 0.20±0.085** 0.33±0.09** 0.41±0.09** 0.26±0.06**

表9 第23天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

表9 第23天時兩組大鼠肝組織基因mRNA表達的變化［（±s），n=8］

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 FXRmRNA Ntcp mRNA Besp mRNA Mrp2 mRNA Mrp3 mRNA Nrf2mRNA CAT mRNA SOD1 mRNA SOD2 mRNA SOD3 mRNA正常組 1.01±0.15 1.02±0.22 1.00±0.09 1.00±0.12 1.03±0.29 1.00±0.12 1.02±0.21 1.02±0.22 1.02±0.21 1.14±0.68模型組 0.38±0.14* 0.45±0.19* 0.38±0.24* 0.46±0.15* 2.05±0.58* 0.65±0.18* 0.63±0.26* 0.32±0.11* 0.40±0.09* 0.30±0.13*

3 討論

肝內膽汁淤積發病機制尚未完全闡明［2］。目前研究認為，肝細胞膽汁酸轉運功能障礙及Nrf2所介導的氧化應激反應是發病的重要環節。FXR是膽汁酸的配體，故又被稱為膽汁酸受體，其可通過調節膽汁酸轉運體如Ntcp、Bsep及Mrp2基因的轉錄、表達來調節膽酸代謝過程［3］。上述膽汁酸轉運體存在于肝細胞和膽小管的細胞膜上，共同參與完成膽汁的形成和分泌過程。另外，肝細胞竇面質膜上還存在一種膽汁酸轉運體——Mrp3，生理情況下維持低表達，當發生膽汁淤積時表達水平明顯升高，促進膽汁酸從肝細胞轉運至血竇，因此，目前認為其是緩解膽汁淤積的一個代償途徑［4］。

Nrf2是調控細胞對抗外來異物和氧化損傷的關鍵轉錄因子，Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應激源的細胞毒性，導致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡。研究發現，Nrf2可被毒性膽汁酸激活，與抗氧化反應元件（ARE）相結合，啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表達，包括超SOD、CAT、GSH-PX等，增強細胞的抗氧化能力，從而提高細胞的存活率［5］。同時，也有研究發現Nrf2可能能夠通過調控部分膽汁酸轉運體基因或蛋白的表達，如BSEP、MRP2及MRP3等，從而影響肝內膽汁淤積的發生及發展［6-7］。KHAMBU等［8］也在膽汁淤積性肝損傷相關研究中發現肝細胞Nrf2參與FXR調節。

ANIT是一種肝毒劑，動物一次性灌服該藥物后可出現與人類膽汁淤積性肝炎相似的血清生化學及肝組織病理學改變，多年來被國內外廣泛用于制作急性肝內膽汁淤積實驗模型［9-10］。該模型于用藥后48 h達疾病高峰，后肝功能逐漸恢復，表現為一種自限性過程，具有簡便、穩定、死亡率低等優點，但其具體機制仍未完全闡明［9-10］。此外，目前較多肝內膽汁淤積的發病表現為亞急性及慢性過程，相關治療藥物也需要一定的療程起效，故長期以來ANIT誘導的急性肝內膽汁淤積模型應用受到一定限制，難以用于較多治療藥物的驗證。多年來，較多研究使用膽總管結扎方法制作慢性膽汁淤積模型，但該模型發病機制與肝內膽汁淤積有明顯不同，也使得相關研究結果在一定程度上缺乏足夠說服力。歐巧群［1］等報道其采用低劑量ANIT間歇重復灌胃的方法制作出了亞急性肝內膽汁淤積大鼠新模型，該方法在4周內很好地維持了大鼠的肝內膽汁淤積狀態，同時病理檢測發現了肝纖維化的早期表現，作者前期研究也成功復制此模型［9］。由于誘導藥物相同，該改進保留了原經典模型的優點，明顯延長模型適用的時間窗。本研究參考以上經驗，建立ANIT誘發的亞急性肝內膽汁淤積大鼠模型。在每周1次低劑量ANIT間隙性灌胃后，生化檢測顯示實驗期間模型組大鼠維持了穩定的肝內膽汁淤積狀態，病理也同樣得到證實，后期已出現早期肝纖維化。研究發現，模型組大鼠肝組織MDA含量在第9、16、23天均較正常組明顯升高，SOD、GSH-Px、CAT的活性明顯降低，CAT、SOD1、SOD2、SOD3的mRNA表達比正常組明顯下降，Nrf2 mRNA表達水平中后期出現明顯的下降，提示ANIT誘導的亞急性肝內膽汁淤積模型存在持續的氧化應激反應。三個時相點模型組肝組織FXR、Ntcp、Bsep、Mrp2的mRNA表達比正常組明顯下降，Mrp3 mRNA表達比正常組明顯增加，表明該模型出現持續的膽汁酸代謝障礙。作者也進一步推測，該模型發病過程中，Nrf2途徑很可能是調控肝臟氧化應激以及膽汁酸轉運功能的關鍵因素。