基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究水蛭素治療慢性腎臟病的分子機制

龍春莉，丘集維，陳玨瑩，林強，謝永祥，史偉

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530004；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是指各種原因引起的腎臟損害或腎功能下降持續(xù)或超過3個月，嚴(yán)重者可發(fā)展至終末期腎臟?。‥SKD）[1]。隨著人口老齡化、慢性疾病的增長，CKD患病率也逐漸上升，成為全球重大的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，全球CKD患病率為9.1%，而我國CKD的患病率為10.8%，患者高達(dá)1.195億人[2-3]。西醫(yī)治療CKD不能有效延緩腎功能進(jìn)展，而中醫(yī)藥治療具有多靶點、多通路、不良反應(yīng)少的特點，在CKD治療中有重要地位[4]。

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是水蛭科螞蟥、水蛭或柳葉螞蟥的干燥全體，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥功效，常被應(yīng)用于腎臟疾病的治療中。水蛭以蛋白質(zhì)及多肽類成分為主，水蛭素（hirudin）是水蛭提取物中的代表性成分，在心腦血管疾病、腎臟病、腫瘤等疾病中均被廣泛使用[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念由Hopkins教授首次于2007年提出，并認(rèn)為研發(fā)多種藥物的設(shè)計方式可以提高臨床療效[6]。近年來，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索中醫(yī)藥的研究逐年增多，其“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)-系統(tǒng)調(diào)節(jié)”的模式特征與中藥多成分、多靶點、多通路的特點具有相似性。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以水蛭中水蛭素為研究對象，整體分析水蛭素調(diào)控CKD的分子機制。

1 資料與方法

1.1 水蛭素結(jié)構(gòu)及對應(yīng)靶點篩選

在PubChem 數(shù)據(jù)庫[7]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以“Hirudin”為檢索詞，檢索水蛭素的SDF結(jié)構(gòu)并下載。將水蛭素的SDF 結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[8]（http://www.swisstargetprediction. ch/）， 設(shè)置物種為“Homo sapiens”，Probability＞0，預(yù)測化合物的潛在作用靶點。利用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建水蛭素靶點網(wǎng)絡(luò)圖[9]。

1.2 慢性腎臟病靶點獲取

以“Chronic Kidney Disease”為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫[10]（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫[11]（https://omim.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫[12]（https://go. drugbank. com/）、TTD數(shù)據(jù)庫[13]（http://db. idrblab. net/ttd/） 中的疾病對應(yīng)靶點。GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點具有Score值，其數(shù)值越高提示該靶點與疾病關(guān)系越密切。若靶點過多，可根據(jù)Score值中位數(shù)情況篩選潛在靶點，合并4個數(shù)據(jù)庫的潛在靶點后，刪除重復(fù)靶點，獲得疾病潛在靶點。通過仙桃學(xué)術(shù)（https://www.xiantao.love/products）在線工具進(jìn)行韋恩圖繪制，對水蛭素和CKD的對應(yīng)靶點進(jìn)行鑒定和交叉分析，以顯示水蛭素與CKD靶點之間的相關(guān)性。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

利用Cytoscape3.8.2軟件的BisoGenet插件[14]構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將獲取的水蛭素及CKD靶點分別導(dǎo)入BisoGenet中，合并二者網(wǎng)絡(luò)圖后提取交集靶點，即水蛭素治療CKD的核心靶點。

1.4 核心靶點的器官定位

將以上獲得的核心靶點導(dǎo)入BioGPS 數(shù)據(jù)庫[15]（http://biogps.org/#goto=welcome）進(jìn)行核心靶點的器官定位，觀察核心靶點在腎臟的表達(dá)情況。

1.5 GO富集和KEGG通路富集分析

將篩選的核心靶點輸入Metascape[16]（http://metascape.org）的靶基因名稱列表，選擇“Homo sapiens”作為GO富集和KEGG富集分析的物種。GO富集分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF），將統(tǒng)計學(xué)意義閾值設(shè)為P＜0.01，并利用微生信在線（http://www.bioinformatics.com.cn/）、易漢博生物信息（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html）網(wǎng)站將分析結(jié)果可視化。

1.6 分子對接

結(jié)合核心靶點“Degree”值選取分子對接的靶點。利用RCSB PBD數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）下載蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，篩選條件：①選擇生物體為“Homo sapiens”；②優(yōu)先選擇口袋完整的結(jié)晶體；③優(yōu)先選擇相似共晶體的晶體結(jié)構(gòu)；④選用X射線衍射法測定蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)；⑤優(yōu)先選擇分辨率高的晶體結(jié)構(gòu)。將篩選后的蛋白通過PyMol 2.4.0軟件進(jìn)行去水、去除多余鏈，將水蛭素化合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為3D結(jié)構(gòu)并做能量最小化處理。將二者文件導(dǎo)入AutoDock Tools轉(zhuǎn)換原子類型后尋找活性口袋，并利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 水蛭素結(jié)構(gòu)及對應(yīng)靶點獲取

在PubChem數(shù)據(jù)庫獲得水蛭素SDF結(jié)構(gòu)，分子式為C287H440N80O113S7。在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫將水蛭素SDF結(jié)構(gòu)上傳后獲取相關(guān)靶點，設(shè)定Probability＞0，最終得到16個靶點，見圖1。

圖1 水蛭素及其對應(yīng)靶點

2.2 慢性腎臟病相關(guān)靶點

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點14 552 個，Score最大值為203.05，最小值為0.18，根據(jù)中位數(shù)，設(shè)定Score＞23的目標(biāo)靶點為潛在靶點，共獲得919個潛在靶點。在OMIM、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫分別檢索到CKD相關(guān)靶點200、27、24個，經(jīng)合并、去重后，最終獲得1 049個CKD相關(guān)靶點。將水蛭素的對應(yīng)靶點與CKD靶點進(jìn)行整合，發(fā)現(xiàn)有4個交集靶點，分別是HLA-A、AVPR2、REN、AGTR1，利用仙桃學(xué)術(shù)在線工具進(jìn)行韋恩圖繪制，見圖2。

圖2 水蛭素-CKD靶點韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點

利用Cytoscape3.8.2軟件的BisoGenet插件分別構(gòu)建水蛭素與CKD的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，與水蛭素潛在靶點產(chǎn)生直接或間接作用的靶點有773個，靶點之間相互關(guān)系13 819條。與CKD潛在靶點產(chǎn)生直接或間接作用的靶點有11 654個，靶點間相互關(guān)系231 354條，二者交集見圖3。

圖3 水蛭素治療CKD交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)水蛭素治療CKD的PPI網(wǎng)絡(luò)和節(jié)點拓?fù)鋮?shù)分析，以度中心性（DC）≥2倍中位數(shù)（即DC≥44）為篩選條件，獲得靶點198個，靶點間相互關(guān)系5 798條。進(jìn)一步以DC、接近中心性（CC）、中介中心性（BC）均大于等于其中位數(shù)（即DC≥74、CC≥0.579、BC≥58.745）為篩選條件，獲得核心靶點73個，共有1 487條相互關(guān)系，結(jié)果見圖4。將水蛭素治療CKD的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，核心靶點中度值前6位的靶點是ITGA4（520）、FN1（391）、VCAM1（377）、NTRK1（356）、MCM2（313）、CUL3（282）。

圖4 水蛭素治療CKD核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點器官定位結(jié)果

為了解核心靶點在腎臟的表達(dá)情況，將以上核心靶點導(dǎo)入BioGPS數(shù)據(jù)庫，得到各個靶點在腎臟的表達(dá)情況。73個核心靶點共獲得71個表達(dá)結(jié)果（2個靶點表達(dá)結(jié)果未檢出）。以基因在腎臟表達(dá)大于其在其他組織器官表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)有5個基因在腎臟的表達(dá)超過其在其他組織器官表達(dá)的中位數(shù)，分別為RPA3、CCDC8、ILF2、EGFR、VCAM1。整理核心靶點在腎臟的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在腎臟表達(dá)最大值為10 601.70（EEF1A1），最小值為2.40（HIST1H3E），以大于在腎臟表達(dá)的中位數(shù)為篩選條件，有36個核心靶點表達(dá)大于中位數(shù)，將結(jié)果導(dǎo)入Excel2016進(jìn)行分析，見圖5。

圖5 水蛭素治療CKD核心靶點在腎臟表達(dá)情況

2.5 核心靶點GO和KEGG富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對以上73個核心靶點進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。將BP、CC、MF富集結(jié)果的LogP值升序排列，對前20位結(jié)果進(jìn)行可視化（見圖6）。BP主要涉及細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄、肽生物合成過程、核糖蛋白復(fù)合物、DNA復(fù)制依賴性核小體等；CC主要涉及游離核糖體、核酸蛋白復(fù)合物、核糖體亞基、黏著斑、蛋白-DNA復(fù)合物等；MF涉及核糖體結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、rRNA結(jié)合等。共獲得KEGG富集通路28條，前20位氣泡圖見圖7，主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞周期信號通路、雌激素信號通路等。

圖6 水蛭素治療CKD核心靶點GO分析條圖

圖7 水蛭素治療CKD核心靶點KEGG通路富集氣泡圖

2.6 分子對接驗證

將核心靶點中度值前6位的靶點（ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1、MCM2、CUL3）與水蛭素進(jìn)行分子對接。分子對接結(jié)果中結(jié)合能（affinity）數(shù)值越小，提示分子中的受體與配體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。當(dāng)affinity＜-7 kcal/mol時，表明二者具有較好的結(jié)合活性[17]。分子對接結(jié)果見表1，affinty＜-7 kcal/mol 的靶點有ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1、MCM2，其 中ITGA4靶點與水蛭素的affinity最小，說明相對于其他靶點，ITGA4與水蛭素的結(jié)合活性最好。

表1 水蛭素與核心靶點分子對接結(jié)果

3 討論

CKD 屬中醫(yī)學(xué)“腰痛”“水腫”“腎風(fēng)”“尿濁”“虛勞”“關(guān)格”“癃閉”等范疇。其本質(zhì)為本虛標(biāo)實，本虛為腎氣不足，標(biāo)實包括多種病理因素，如“濕”“瘀”“毒”等邪實。結(jié)合CKD遷延不愈的特征，可見其病程久而復(fù)雜，溫病學(xué)派創(chuàng)始人葉天士認(rèn)為，初病氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)。諸多醫(yī)家認(rèn)為，瘀血貫穿疾病的全程[18]。水蛭常被用于治療瘀血證?！侗静輩R言》有“逐惡血、瘀血之藥也”；《本草從新》有“治水腫、敗毒”。金智生教授在臨床實踐中常用水蛭治療腎臟病，認(rèn)為水蛭具有“味咸專入血分，于氣分毫無損害，而瘀血默消于無形”的功效[19]。莫宇鳳等[20]探索治療CKD的壯醫(yī)藥用藥規(guī)律，其中包含水蛭的通兩路（龍路、火路）藥使用頻次為43次，可見水蛭在治療CKD中的重要地位。水蛭素作為水蛭的主要活性成分，藥理學(xué)研究表明，其具有抗凝、抗血栓、抗纖維化、調(diào)節(jié)微血管再生、抗腫瘤、改善腎功能等作用[21]。

水蛭素被認(rèn)為是作用最強的天然凝血酶特異性抑制劑，由65～66個氨基酸組成，分子量約7 000[22-23]，可顯著抑制促炎信號通路，降低促炎因子白細(xì)胞介素-1b、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8表達(dá)，通過降低腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1和纖維連接蛋白1表達(dá)及Ⅳ型膠原沉積抑制腎纖維化[24]。本研究經(jīng)篩選后共獲得水蛭素治療CKD核心靶點73個。江欣等[25]通過同位素追蹤法檢測水蛭素在大耳兔中分布情況，實驗結(jié)果表明，在實驗中的每個時間點，水蛭素在腎臟的分布均高于其他組織，其次為血漿，證實水蛭素主要通過腎臟排泄，這從另一方面體現(xiàn)水蛭素治療腎臟疾病的優(yōu)勢。根據(jù)度值大小來看，排名靠前的有ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1。整合素的表達(dá)及缺失與腎臟疾病存在相關(guān)性[26]，ITGA4作為整合素α鏈蛋白家族成員之一，在腎臟中也參與部分調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)血管炎患者中抗髓過氧化物酶抗體通過α4-整合素誘導(dǎo)腎小球毛細(xì)血管內(nèi)白細(xì)胞黏附[27]。FN1是分子量270 kD的糖蛋白，在腎小球壓力增高時可引起足細(xì)胞對其表達(dá)上調(diào)，同時又與整合素及細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原、纖維蛋白等結(jié)合，共同起保護(hù)腎臟作用[28]。VCAM1能反映血管內(nèi)損傷，并參與CKD 炎癥反應(yīng)，其水平高低影響CKD 的進(jìn)展[29]。NTRK1不僅在大腦中表達(dá)，而且在腎臟和周圍神經(jīng)中表達(dá)，可能在NGF-TrkA信號作用下突變，導(dǎo)致該家族中的腎臟疾病[30]。由圖5可見，EEF1A1、UBC是腎臟中表達(dá)較高的關(guān)鍵靶點。EEF1A1在衰老的腎小管細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，是腎小管上皮細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物，還涉及細(xì)胞骨架重塑、蛋白質(zhì)折疊和降解、細(xì)胞信號調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等[31]。UBC參與調(diào)節(jié)CKD中肌肉萎縮，通過激活半胱氨酸酶-3和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)刺激肌肉中蛋白質(zhì)降解[32]。

KEGG通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞周期信號通路、雌激素信號通路等。PI3K-Akt信號通路是CKD的重要信號通路之一，在低氧誘導(dǎo)下，腎小管間質(zhì)纖維化和功能障礙加速CKD的進(jìn)程[33]。PI3K是該通路的起始因子，而Akt是PI3K的下游靶點，抑制PI3K可以減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而抑制Akt 可導(dǎo)致梗阻性腎病的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物減少[34]。通過激活PI3K/Akt信號通路，降低有絲分裂活性而抑制氧化應(yīng)激和炎癥是治療CKD的一種策略[35]。MAPK 信號通路在腎病中起重要作用，其關(guān)鍵因子（JNK和p38）與細(xì)胞凋亡和炎癥有關(guān)。JNK信號通路能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎和促纖維化分子，并促進(jìn)腎小管細(xì)胞向間質(zhì)表型分化[36]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1可激活p38MAPK信號通路，使炎癥因子表達(dá)增多，加劇腎小球硬化及腎纖維化[37]。而水蛭素可通過p38MAPK/NF-κB途徑抑制糖尿病腎病大鼠炎癥反應(yīng)，防止足細(xì)胞凋亡，對腎臟損傷有保護(hù)作用[38]。

綜上所述，水蛭素治療CKD可通過多靶點、多通路延緩疾病進(jìn)展。然而本研究存在以下不足：①網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究依賴現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)資料，而數(shù)據(jù)的完整性及真實性會影響研究結(jié)果的誤差，甚至出現(xiàn)假陽性或假陰性[39]；②網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究依賴多種軟件平臺的運用，而每個軟件的運算機制有所差異，如針對通路富集分析的平臺有Metascape、 DAVID、Cytoscape 等，本研究未能針對每個平臺進(jìn)行分析；③本研究未能對水蛭素相關(guān)靶點與通路做進(jìn)一步的實驗研究。后期將繼續(xù)關(guān)注該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，對相關(guān)靶點和通路進(jìn)行深入探究。