基于網絡藥理學分析黃芪-附子治療慢性心力衰竭的作用機制

李俊輝，李悅，朱靈妍，姚成增

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；3.上海市徐匯區中心醫院，上海 200031

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種原因引起心臟功能或結構異常，使心臟泵血量減少，不能滿足組織器官代謝需求的臨床綜合征[1]。CHF是大多數心血管疾病的終末階段，患病率和致死率逐年升高，給社會帶來極大負擔[2]。西醫常用利尿劑、強心劑和β受體阻滯劑等改善CHF癥狀，但長期服藥會出現不同程度的不良反應，整體療效及安全性仍有待提高。中醫藥治療CHF療效確切、不良反應少，可明顯改善患者癥狀，提高生活質量。中醫認為，CHF病機為本虛標實，治療應以溫補陽氣為主，兼活血、利水、行氣[3]，臨床多用黃芪-附子等溫補陽氣藥對為代表的方劑，療效滿意。但目前鮮有關于黃芪-附子治療CHF機制的論述，本研究基于網絡藥理學方法分析黃芪-附子治療CHF的潛在作用機制，以期為臨床治療CHF提供依據。

1 資料與方法

1.1 黃芪-附子活性成分篩選及靶點獲取

在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]數據庫以“huangqi”“fuzi”為關鍵詞進行檢索，獲取黃芪-附子活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進一步篩選有效成分。通過TCMSP 數據庫查詢有效成分對應靶點，并導入UniProt（https://sparql.uniprot.org/）數據庫對靶點名稱進行標準化處理。

1.2 疾病靶點及交集靶點獲取

在PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）[5]、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）[6]、OMIM（https://omim.org/）數據庫以“chronic heart failure”為關鍵詞檢索CHF相關靶點，將疾病靶點與藥物靶點取交集，交集靶點即黃芪-附子治療CHF的潛在靶點。

1.3 蛋白相互作用網絡構建

將交集靶點導入STRING（https://www.string-db.org/）[7]平臺，繪制蛋白相互作用（PPI）網絡，將PPI網絡導入Cytoscape3.7.2軟件進一步簡化篩選，獲取核心靶點網絡。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R語言3.6.3軟件相關數據包對交集靶點進行GO功能和KEGG富集分析，篩選qvalue＜0.05的分析結果進行展示。

2 結果

2.1 藥物活性成分與靶點

在TCMSP獲取黃芪活性成分20個，附子活性成分21個，無共有成分。進一步獲取活性成分對應的靶點，有19個活性成分無對應靶點，剩余22個活性成分（見表1）對應靶點492個，去除重復后得到靶點191個。將靶點導入UniProt數據庫轉化為UniProt ID，通過Cytoscape3.7.2 軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡（見圖1），節點越大度值越大，節點間連線表示相互作用關系，活性成分平均度值為20.63，按度值由大到小排序，前10位活性成分見表2。

表2 黃芪-附子活性成分（度值前10位）

圖1 黃芪-附子治療CHF藥物-活性成分-靶點網絡

表1 黃芪-附子主要活性成分

2.2 疾病靶點及交集靶點

在PharmGKB、TTD、GeneCards、OMIM數據庫分別得到CHF靶點16、13、10 531、153個，經去重后，共得到CHF相關靶點10 573個。利用Excel2016將疾病靶點和藥物靶點取交集，得到交集靶點183個，Venn圖見圖2。

圖2 黃芪-附子治療CHF靶點Venn圖

2.3 蛋白相互作用網絡

將183個交集靶點導入STRING數據庫，建立黃芪-附子治療CHF 靶點PPI 網絡，見圖3。利用Cytoscape3.7.2軟件對網絡進行拓撲分析，篩選中介中心性（between centrality）≥19.565、緊密中心性（closeness centrality） ≥0.561、度中心性（degree centrality）≥10.5、特征向量中心性（eigenvector centrality）≥0.136、位置中心性（location centrality）≥4.558、鄰域連通性（neighborhood connectivity）≥5.910的靶點，最終得到由14個核心靶點、108條邊組成的核心靶點PPI網絡，見圖4。

圖3 黃芪-附子治療CHF靶點PPI網絡

圖4 黃芪-附子治療CHF核心靶點PPI網絡

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析結果

對交集靶點進行GO分析，得到2 625個條目，包括生物過程（BP）2 324 個、細胞組分（CC）88 個，分子功能（MF）213個，結果按qvalue從小到大排序，BP、CC、MF前10個條目見圖5。BP主要涉及細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、對藥物的反應（response to drug）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）等；CC 主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微區（membrane microdomain）、膜區（membrane region）等；MF主要涉及DNA/RNA轉錄因子活性、蛋白受體活性。KEGG通路富集分析篩選前30 條通路，主要包括AGE-RAGE 信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路等，見圖6。

圖5 黃芪-附子治療CHF靶點GO富集分析

圖6 黃芪-附子治療CHF靶點KEGG通路富集分析

3 討論

現代醫學認為，血脂、血糖、血壓異常及吸煙、飲酒、飲食失節等不良生活習慣會影響或加快CHF進程，主要從增加心肌收縮力、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）激活等角度治療。古代文獻有與CHF臨床表現相似的描述，如《素問·舉痛論篇》“勞則喘息汗出，外內皆越，故氣耗矣”，《金匱要略》“心水者，其身重而少氣，不得臥，煩而躁，其人陰腫”，《靈樞·脹論》“夫心脹者，煩心短氣，臥不安”。CHF可屬中醫學“心水”“心脹”等范疇，病機為本虛標實，臨床以氣虛證為主。氣虛無力推動血行而成瘀，故標實多以血瘀居多，治法多以溫陽補氣為主[8]，兼以活血。黃芪性溫，歸脾、肺經，有補氣升陽、行血通滯之功；附子性大熱，歸心、脾、腎經，有回陽救逆、補火助陽之功。二者相須使用則心氣得溫，心陽得補，心血得通，氣虛之證得除。史君等[9]對近20年治療CHF的方劑進行分析，結果顯示，使用頻率最高的中藥為黃芪，附子排名第4位，可知黃芪-附子廣泛應用于CHF治療。

高血壓、高血脂是心力衰竭的危險因素，心肌重構是心力衰竭發展的必然病理結果，炎癥反應貫穿心力衰竭發生發展[10]。本文通過網絡藥理學方法，在TCMSP篩選黃芪-附子活性成分22個，在UniPort數據庫獲得相關靶點191個，藥物-活性成分-靶點網絡中度值較高的有槲皮素、 山柰酚、 7-Omethylisomucronulatol、異鼠李素、芒柄花素、3,9-di-O-methylnissolin、毛蕊異黃酮等。槲皮素、山柰酚、芒柄花素均為黃酮類化合物，槲皮素可通過多途徑預防或延緩心力衰竭進程[11]，通過抑制血管緊張素Ⅱ降低心肌纖維化和心肌肥大，從而改善心肌重構[12-13]。山柰酚可通過調節核因子E2相關因子、核因子-κB和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制心肌細胞凋亡，從而起到保護心臟作用[14]。芒柄花素可通過調節一氧化氮合成酶、5-羥色胺2A/1B受體和1-adrenoceptors表達降低血壓[15]，抑制脂肪生成[16]。此外，β-谷甾醇[17]、異鼠李素[18]、脫氧烏頭堿[19]等活性成分也能從多角度發揮延緩心力衰竭的作用。黃芪-附子治療CHF度值較高的有效成分，如槲皮素、山柰酚、芒柄花素等可關聯到PPI網絡中評分較高的靶點，并且可富集到與CHF有關的通路。因此，推測以槲皮素、山柰酚、芒柄花素為代表的活性成分可能在CHF治療中發揮重要作用。

核心靶點PPI網絡中共有14個靶點，其中AKT1是AKT家族的成員之一，有實驗表明，敲除AKT1基因小鼠，其胎兒死亡率顯著高于對照組[20]，且存活小鼠心功能低于對照組。AKT1對心臟的影響主要表現為抑制心肌細胞凋亡，Kapustian等[21]研究表明，心力衰竭小鼠p-AKT1呈低表達，激活AKT1對CHF有一定治療作用。MAPK14又稱p38α，能被多種刺激因素激活，如白細胞介素（IL）-1、脂多糖、腫瘤壞死因子（TNF）-α、缺血、缺氧等[22-23]，MAPK14激活會引起心肌細胞肥大、凋亡或收縮功能障礙，Kompa等[24]觀察MAPK14抑制劑對心肌梗死小鼠心肌纖維化、心肌肥大的影響發現，MAPK14抑制劑能改善心功能，減少心肌梗死后心臟重構，防止其進一步發展為心力衰竭。IL-6是一種多功能的細胞因子，大部分研究表明，其在CHF發展過程中表現為促進炎癥發展作用[25-26]。Kobara等[27]研究表明，給予心肌梗死后小鼠IL-6拮抗劑可以抑制炎癥，改善左心室重構。KEGG通路富集分析主要集中在PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路，其中PI3K-Akt信號通路富集的基因最多。PI3K-Akt信號通路是生物體內關鍵的通路，通過激活細胞內各種信號蛋白表現其生物學功能，包括細胞凋亡、轉移、分化、代謝、蛋白質合成、細胞運動及囊泡轉移等[28-29]，激活PI3Kα可促進TNF-β和miR-21表達，抑制心肌肥大[30]，激活PI3Kγ會損害心功能，降低心肌收縮力[31]。PI3K-Akt信號通路的下游靶點mTOR、GSK3、FoxOs 等亦參與心力衰竭的過程，有研究表明，mTOR抑制劑可抑制轉化生長因子-β誘導的心肌纖維化標志物α-平滑肌肌動蛋白表達[32]，此外，RAGE能抑制PI3K-Akt信號通路，增加心肌細胞自噬，抑制RAGE對心肌細胞有保護作用[33]。由此推測，黃芪-附子治療CHF可能與調控心肌細胞凋亡、改善心室重構有關，可能是以AKT1為靶點調控PI3KAkt信號通路改善心功能。

綜上所述，黃芪-附子可能通過槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分，作用于AKT1、MAPK14等靶點，直接或間接調控PI3K-Akt、AGE-RAGE等多條信號通路，干預CHF的各個過程。體現了黃芪-附子通過多成分、多靶點、多通路治療CHF的特點。