基于系統生物學的針刺治療經脈分子機制研究

王晰，雷蕾，熊婕，李海燕，孫華君，劉華云，韓晨靜

1.中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700；2.天津中醫藥大學，天津 301617

中醫認為生命能量或氣通過經脈系統流動。經脈系統包括十二經脈和奇經八脈，通常我們分析十四經脈，即十二經脈、任脈和督脈。隨著生物醫學的快速發展，從生物機制方面詮釋經絡系統可在一定程度上從現代醫學角度認識傳統經脈，有助于理解中醫理論中針灸的現代醫學內涵，建立中西醫溝通的橋梁。瞿巧鈺[1]通過動物實驗發現，針刺肺經“太淵”能治療小鼠哮喘，可能與調節毒蕈堿受體M1、M2、M3表達有關。鐘艷等[2]研究不同經脈配穴法針刺對急性胃黏膜損傷大鼠相關細胞因子表達的影響，發現表里經配穴法側重于調整腫瘤壞死因子-α，生長抑素的合成、釋放及促進表皮生長因子的表達。

系統生物學可以從改善或恢復生物網絡平衡的角度認識生物學機制，從而對生物系統網絡進行整體分析。Han等[3]采用系統生物學方法，通過文本挖掘、生物信息學、網絡拓撲學等計算，系統揭示針刺治療COVID-19的多靶點機制。本課題組前期構建了針刺效應數據展示平臺（http://acupuncture.cintcm.ac.cn:8080/pviewer/），采集了大量針刺動物實驗機制研究數據。本文以針刺穴位及產生調控作用的靶點為研究對象，通過計算獲得十四經脈常見的穴位、作用靶點，利用系統生物學方法開展經脈共性生物學表征分析，為經脈的現代生物學機制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 腧穴和靶點獲取

本研究腧穴和靶點原始數據來自針刺效應數據展示平臺動物實驗數據[4]，該平臺有嚴格的文獻納入和排除標準，目前已經納入2019年及以前的針刺動物實驗文獻14 284篇，涉及穴位459個，累計頻次19 943次，功能評分、微觀機能、分子水平（靶點數據）等針刺效應頻次累計7 565次。

考慮到針刺一組穴位對相應基因表達的影響并不能清楚反映單獨腧穴與基因的關系，不利于深入探究腧穴、經脈和靶點之間的關系。因此選擇針刺單獨穴位的相應基因表達數據進行進一步分析。最終納入文獻1 194篇，涉及腧穴99個，對應靶點422個。

1.2 數據規范及標準化

穴位名稱及歸經參照《腧穴名稱與定位》[5]進行標準化處理，如將“關原”規范為“關元”。以上過程由2名數據人員獨立完成，一名加工，一名審校，確認無誤后納入數據庫使用。使用UniProt 數據庫（http://www.uniprot.org/uniprot/）將靶點蛋白英文名稱統一規范為人類基因名稱。

1.3 數據分析

使用Microsoft Office Access2007對規范后的數據進行頻次統計。使用Cytoscape3.8.2軟件構建經脈-腧穴-靶點網絡，選取Degree值＞9的節點作為核心靶點，使用Metascape（https://metascape.org/gp/index.html）對核心靶點進行GO 功能、KEGG 通路富集分析和DisGeNET 富集分析，以Pvalue≤0.05 選取生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組分（CC）、KEGG通路和DisGeNET結果。計算結果導入易漢博在線繪圖平臺（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/）進行可視化處理。最后，使用DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對十四經脈特異性靶點相關疾病進行分析，勾選GAD_DISEASE、GAD_DISEASE_CLASS和OMIM_DISEASE，其余為系統默認值。

2 結果

2.1 腧穴歸經

參照《腧穴名稱與定位》對納入的99個腧穴所屬經脈進行統計，其中73個腧穴可歸入十四經脈，見表1。

表1 73個腧穴所屬經脈統計

2.2 經脈-穴位-靶點相互作用網絡

十四經脈涉及腧穴73個，對應的不重復靶點399個，其中足陽明胃經對應靶點最多，有206個，督脈其次，對應靶點159個，見圖1。

圖1 十四經脈腧穴對應靶點

利用Cytoscape3.8.2軟件構建經脈-腧穴-靶點相互作用網絡，見圖2。該網絡包括486個節點和1 110個相互作用關系，網絡的平均自由度為4.6。選取Degree值＞9的49個靶點作為針刺十四經脈效應的核心靶點，構建經脈-腧穴-靶點核心網絡（包括4條經脈、26個腧穴和19個靶點），見圖3。

圖2 針刺效應經脈-腧穴-靶點相互作用網絡

圖3 針刺效應經脈-腧穴-靶點核心網絡

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

對核心網絡包含的19個靶點進行GO功能富集分析，共得到573條結果；KEGG通路富集分析得到99條通路。根據Metascape 分類，分別篩選每一類中LogP最小的結果制作可視化氣泡圖，見圖4。結果顯示，與十四經脈密切相關的BP有凋亡信號通路、白細胞分化、對藥物的反應、系統過程的調節、免疫球蛋白產生的調節等；CC有軸突、膜筏、神經元細胞體、溶解液泡、線粒體膜等；MF有細胞因子受體結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合、G蛋白偶聯受體結合、細胞黏附分子結合、蛋白質同源二聚化活性等。與十四經脈密切相關的通路有T細胞受體信號通路、神經營養素信號通路、HIF-1信號通路等。

圖4 核心靶點GO功能富集和KEGG通路富集氣泡圖

2.4 經脈比較分析

使用Matescape分析十四經脈的靶點，見圖5。可以看出，足陽明胃經（ST）、督脈（GV）、手厥陰心包經（PC）內環淺橙色部分較多，說明這3條經脈的特異性靶點較多。足陽明胃經（ST）特異性靶點有ABCA1、CCL5、TIMP1、CCL2、RHEB等83個；督脈（GV）特異性靶點有GFRA1、FRA1、TNFRSF11 B、AGTR1、APLNR、CNR1等50個；手厥陰心包經（PC）特異性靶點有ADORA2A、CYP2B6、ABCB1、GNAS、NLRP3等50個。

圖5 十四經脈對應靶點的Circos圖

2.5 DisGeNET富集分析

得到與十四經脈相關的20個疾病，見圖6，具體包括炎癥、認知障礙、實驗性糖尿病、腦缺血、記憶障礙、神經痛、老年前期癡呆、內皮功能障礙、急性胰腺炎、蛛網膜下腔出血、急性心肌梗死、淀粉樣變、免疫抑制、腦梗死、再灌注損傷、大腦中動脈閉塞、脂肪肝、特應性皮炎、呼吸道合胞病毒（RSV）在其他分類條件下和未指定部位的感染、痛覺過敏。

圖6 十四經脈靶點DisGeNET富集分析熱圖

3 討論

經脈學說是我國人民在長期臨床實踐中總結出來的，對臨床研究具有巨大的指導價值，經脈的本質研究仍是學術界的熱門領域。本文基于針刺效應的動物實驗文獻，首先觀察到研究數量最多的十四經脈有足陽明胃經、督脈、手厥陰心包經和足太陽膀胱經，而通過核心網絡分析得到Degree值較高的十四經脈也包括足陽明胃經、督脈、足少陽膽經和足太陽膀胱經。結果顯示，在針刺效應經脈-腧穴-靶點網絡中，足少陽膽經比手厥陰心包經更為重要，可能因膽經與胃經、膀胱經關系更緊密，治療病證更廣泛。足陽明胃經、足少陽膽經、足太陽膀胱經皆為足陽經，循行路線相似，三經的腧穴均可治療頭面、五官、頸項、胸腹等病證[6]。

3.1 系統生物學分析結果體現出經脈的廣譜調節作用

十四經脈對應的靶點有399個，核心靶點19個，其中IL6在免疫、組織再生和代謝方面具有多種生物學功能[7]。IL10是主要的免疫調節細胞因子[8]。BDNF在發育過程中可促進外周和中樞神經系統選定神經元群的存活和分化[9]。NGF對于交感神經和感覺神經系統的發育和維持非常重要[10]。GO富集分析結果顯示，與十四經脈密切相關的BP有系統過程的調節、細胞對生長因子刺激的反應、免疫球蛋白產生的調節等。此外KEGG通路富集分析發現，與十四經脈密切相關的通路有T細胞受體信號通路、神經營養素信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等。這些都體現出針刺效應的廣譜調節作用，針刺對神經內分泌系統、神經免疫系統有調節作用，可觸發人體廣譜反應系統。而針刺的廣譜性在臨床上也得到了證實，據不完全統計，足三里已在183種現代疾病的針刺治療中得到應用，幾乎涵蓋了針灸有效疾病的所有病種[6]。

3.2 系統生物學分析結果體現出經脈的特異調節作用

與此同時，針刺效應還具有特異性。本文從十四經脈對應的靶點比較發現，除了對應靶點較少的手太陽小腸經和手太陰肺經外，其余經脈都有特異的靶點，其中足陽明胃經、督脈和手厥陰心包經對應的特異性靶點最多。足陽明胃經對應206個靶點，其中83個靶點為特異性靶點。足陽明胃經在胸部穴位以治療呼吸循環疾病為主，腹部及下肢穴位以治療消化系統疾病、泌尿系統疾病和局部神經肌肉病變為主。足陽明胃經對應的特異性靶點中，ABCA1與脂肪消化吸收通路相關[11]，TIMP1 與胃炎、幽門螺桿菌感染、胃腫瘤相關[12]，CCL2與哮喘相關[13]，CCL5與膀胱癌相關[14]。督脈對應159個靶點，其中50個靶點為特異性靶點。督脈的下腹部穴位主治泌尿和腸道疾病，上腹部穴位主治胃、腸、肝、脾疾病，胸段主治胸部內臟疾病。根據“1.3”項下DAVID6.8的分析方法，可以得到督脈對應的特異性靶點GFRA1 相關膀胱輸尿管反流，FRA1相關先天性巨結腸，TNFRSF11B相關大腸桿菌感染，AGTR1相關胃腸道出血大腸癌，APLNR相關原腸胚形成，CNR1相關腸易激綜合征和慢性潰瘍性結腸炎。手厥陰心包經對應134個靶點，其中50個靶點為特異性靶點。手厥陰心包經穴位主治循環、神經系統疾病、發熱性疾病和局部神經肌肉疾病，得到手厥陰心包經對應的特異性靶點ADORA2A相關血液循環疾病、CYP2B6 相關依法韋侖中樞神經系統疾病、ABCB1相關中樞神經系統復發、GNAS相關自主神經系統疾病、NLRP3相關神經垂體尿崩癥。

3.3 系統生物學架起針灸治療中醫疾病與現代醫學疾病關聯的橋梁

中醫疾病與現代醫學疾病很少有一一對應關系，因此從基因角度找到中醫學與現代醫學的相關關系很有意義。十四經脈對應靶點的DisGeNET富集分析顯示，有一些結論與現代研究相符，例如認知障礙和足陽明胃經、任脈、手厥陰心包經、足太陽膀胱經、足少陽膽經、手陽明大腸經等顯著相關。劉濤等[15]發現，臨床上認知障礙的治療重在督脈、足太陽膀胱經的應用。王亞飛等[16]發表了以督脈穴位為主治療缺血性腦血管疾病的綜述。陳俊伍等[17]認為針刺輔助治療急性胰腺炎選穴優選足陽明胃經、任脈、足太陽膀胱經、手厥陰心包經。胡鑫才等[18]發現針灸治療非酒精性脂肪肝常選用足陽明胃經、足太陰脾經、足厥陰肝經、任脈、手陽明大腸經。而有一些現代疾病，如蛛網膜下腔出血、老年前期癡呆、內皮功能障礙、免疫抑制等目前并沒有研究報道臨床治療與經脈的關系，本文從DisGeNET富集結果可以推測這些疾病的臨床治療可以考慮從足陽明胃經、督脈、手厥陰心包經、足太陽膀胱經、足少陽膽經、手陽明大腸經等入手。

綜上所述，本文通過系統生物學方法研究十四經脈的分子機制，一方面證實了針刺經脈具有廣譜效應，這與調節神經內分泌系統、神經免疫系統有密切關系；另一方面通過對每個經脈特異性靶點的分析，發現十四經脈的靶點具有特異性，這也是循經針刺可能的分子機制。最后，從十四經脈對應靶點的DisGeNET富集分析可以得到針刺治療疾病的思路和依據。