馬鈴薯多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)及酶促合成茶黃素能力對(duì)比

李東，張?jiān)婄鳎沼罚峦铎o雅，李宇豪

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005)

茶黃素類物質(zhì)(theaflavins，TFs) 是紅茶中非常重要的天然及活性物質(zhì)來源之一，是天然的著色劑，具有抗氧化[1-3]、抗炎癥[4]、降血糖、降血脂[5]等多種功能。外源酶促氧化法合成茶黃素成為現(xiàn)階段高效制備TFs的方法，即兒茶素類物質(zhì)在多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的催化作用下合成TFs[6]。研究者們[7-14]通過多種植物酶源研究不同PPO對(duì)兒茶素酶促氧化合成茶黃素的影響，但因不同植物源的PPO的結(jié)構(gòu)、組織、發(fā)育期表達(dá)等方面的不同，酶的催化作用及其底物特性之間差異性較大[15]。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)馬鈴薯、紅薯、芋頭、山藥、蘋果、豐水梨、貢梨、香蕉、李子、青棗10種植物來源的PPO催化茶黃素的能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)將馬鈴薯PPO作為植物酶源催化兒茶素具有較強(qiáng)催化合成TFs的能力。但由于馬鈴薯具有多個(gè)品種，品種的不同使酶活力和同工酶表現(xiàn)出時(shí)空特異性[16]，TFs產(chǎn)量及其各單體間的比例因馬鈴薯品種不同而具有差異性。目前馬鈴薯PPO的酶促褐變[17]及活性分析[18]成為許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)，但針對(duì)不同馬鈴薯PPO合成各茶黃素單體及TFs的選擇的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究結(jié)合馬鈴薯PPO酶學(xué)性質(zhì)的對(duì)比，通過不同品種馬鈴薯PPO酶促氧化茶多酚合成TFs的能力來篩選出最佳的馬鈴薯品種，將為工業(yè)化制備高產(chǎn)量TFs提供一定的酶促原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯(黃心、黑美人、大牛角、紅玫瑰、大白花)：新鮮市售；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、鄰苯二酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)：均為分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司；茶多酚：上海麥克林生化科技有限公司；茶黃素(theaflavin，TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黃素-3′-沒食子酸酯(theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G)、茶黃素-3,3'-沒食子酸酯(theaflavin-3,3'-gallate，TF-3,3'-G)：標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀、EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 2.7 μm) 美國Agilent科技有限公司；PHS-3E pH計(jì)、N5000 Plus分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；HZ150L恒溫培養(yǎng)搖床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；TG16高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；M1-L23B美的微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司；JJ-2B組織勻漿機(jī) 金壇區(qū)指前鎮(zhèn)旭日實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多酚氧化酶酶液的制備

參考崔曉穎等[19]提取芋頭PPO的方法進(jìn)行修改，采用勻漿浸提法提取不同品種馬鈴薯PPO。分別稱取等量不同品種切塊馬鈴薯，加入到400 mL含1% PVPP的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液中(0.05 mol/L，pH 7.6)，用組織勻漿機(jī)勻漿5 min，將勻漿液放入4 ℃冰箱中提取12 h，過濾后離心(4 ℃， 8 500 r/min， 30 min)，離心后以上液作PPO酶液。

1.3.2 PPO酶活力的測(cè)定

PPO酶活力參考袁斌等[20]對(duì)酶活的檢測(cè)方法并進(jìn)行修改，使用分光光度計(jì)進(jìn)行酶活力的測(cè)定。取1.5 mL緩沖液和0.5 mL PPO酶液于25 ℃水浴中4 min后，迅速加入0.5 mL鄰苯二酚溶液，記錄30 s內(nèi)420 nm處吸光度的相對(duì)變化幅值，重復(fù)3次。空白對(duì)照以滅活酶代替。酶活力定義：吸光度在420 nm處1 min內(nèi)變化0.001為一個(gè)酶活力單位(U)。

式中：ΔOD420為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度變化值，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，V1為酶提取液的總體積(mL)，V2為取樣比色體積(mL)。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度利用考馬斯亮藍(lán)法[21]進(jìn)行測(cè)定，建立蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y=0.104 77X+0.087 6(R2=0.999 2)。

式中：以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y。

取10 μL酶液加水稀釋10倍，加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，混勻后在595 nm波長下測(cè)定吸光度值，計(jì)算待測(cè)蛋白樣品含量。

將比活力(U/mg)定義為每毫克蛋白質(zhì)所含有的酶活力數(shù)。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)對(duì)比

1.3.4.1 不同品種馬鈴薯PPO最適反應(yīng)溫度的對(duì)比

分別取不同品種馬鈴薯PPO酶液0.5 mL，設(shè)置反應(yīng)溫度分別為20，30，40，50，60，70，80 ℃，參照“1.3.2”對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 不同品種馬鈴薯PPO最適反應(yīng)pH的對(duì)比

分別取不同品種馬鈴薯PPO酶液0.5 mL，設(shè)置酶反應(yīng)體系緩沖液pH分別為5.6，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0，參照“1.3.2”對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.3 不同品種馬鈴薯最適反應(yīng)底物濃度的對(duì)比

在前期已對(duì)幾個(gè)不同底物進(jìn)行對(duì)比，選擇鄰苯二酚作為底物其酶活性相對(duì)較高。分別取不同品種馬鈴薯PPO酶液0.5 mL，設(shè)置鄰苯二酚濃度分別為20，30，40，50，60，70，80，90 mmol/L，參照“1.3.2”對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 不同品種馬鈴薯PPO酶促制備茶黃素類物質(zhì)生成量的對(duì)比

參考黃瑩捷等[22]對(duì)勐庫大葉種PPO進(jìn)行酶促反應(yīng)合成茶黃素方法進(jìn)行修改。酶促反應(yīng)體系由濃度為5 mg/mL的反應(yīng)底物溶液(茶多酚與磷酸緩沖液)與5 mL的馬鈴薯PPO溶液組成。放入搖床中30 ℃劇烈振蕩90 min。在反應(yīng)完成后，放入100 ℃水浴鍋中保持10 min終止反應(yīng)。5 000 r/min離心10 min后取上清液過0.22 μm微孔濾膜，所得濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.3.6 茶黃素類物質(zhì)含量的測(cè)定

采用EC-C18色譜柱，流動(dòng)相分別為0.1%甲酸溶液和乙腈溶液，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長280 nm。梯度洗脫程序見表1。根據(jù)該色譜條件測(cè)定茶黃素類物質(zhì)的生成量。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Waller-Duncan檢驗(yàn)方法進(jìn)行多重比較，使用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種馬鈴薯PPO酶蛋白含量及其酶活力的對(duì)比

在相同條件下對(duì)不同品種馬鈴薯PPO進(jìn)行酶蛋白含量測(cè)定，結(jié)果見圖1。馬鈴薯的酶促褐變程度通常可以用酶蛋白含量來表示。5個(gè)品種中黃心馬鈴薯PPO酶蛋白含量顯著高于其余4個(gè)品種，達(dá)到(170.45±5.20) mg，最易褐變，大白花馬鈴薯PPO酶蛋白含量最低，為(80.64±15.32) mg，相對(duì)于其余4個(gè)品種PPO最不易發(fā)生酶促褐變。在相同適宜環(huán)境下，測(cè)定5個(gè)品種PPO的酶活力及比活力，結(jié)果見表2。通過5個(gè)品種酶活力與比活力的對(duì)比，可知黃心馬鈴薯、大牛角馬鈴薯兩種PPO表現(xiàn)出高酶活力。

圖1 不同品種馬鈴薯PPO酶蛋白含量Fig.1 Content of PPO enzyme protein in different varieties of potatoes

表2 不同品種馬鈴薯PPO酶活力及比活力Table 2 PPO enzyme activity and specific activity of different varieties of potatoes

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)不同品種馬鈴薯PPO酶活力的影響

在不同溫度下測(cè)定5個(gè)品種馬鈴薯PPO酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 不同品種馬鈴薯PPO在不同溫度下酶活力Fig.2 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes at different temperatures

由圖2可知，在反應(yīng)溫度從20 ℃增至80 ℃的過程中，PPO的相對(duì)酶活力整體呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢(shì)。黃心、紅玫瑰、黑美人和大白花PPO在溫度為30 ℃時(shí)酶活力分別達(dá)到最大值，其酶活力均顯著高于該品種下不同溫度的酶活力。大牛角PPO在溫度為40 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，在不同溫度下酶活力的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

最適溫度即在該溫度下其酶活力達(dá)到最大值。黃心、紅玫瑰、黑美人和大白花PPO在溫度為30 ℃時(shí)酶活力分別達(dá)到最大值，即30 ℃為最適溫度。大牛角PPO在溫度為40 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，即最適溫度為40 ℃。對(duì)比最適溫度下5種不同馬鈴薯PPO酶活力可以看出，黃心、大牛角和黑美人PPO酶活力較高，大白花PPO酶活力最低。不同PPO的最適溫度不同，但都在30～40 ℃之間，在80 ℃下幾乎喪失了酶活力。

2.3 反應(yīng)pH對(duì)不同品種馬鈴薯PPO酶活力的影響

在不同pH值緩沖液中測(cè)定5種馬鈴薯PPO酶活力，結(jié)果見圖3。

圖3 不同品種馬鈴薯PPO在不同pH下酶活力Fig.3 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes at different pH values

由圖3可知，隨著pH的增大，不同品種馬鈴薯PPO均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。其中黑美人與紅玫瑰馬鈴薯PPO在pH為6.0時(shí)酶活力達(dá)到最大值，即pH 6.0是該兩個(gè)品種的最適pH。黃心馬鈴薯PPO與大白花馬鈴薯PPO在pH為6.8時(shí)酶活力達(dá)到最大值，分別為334 U和199.67 U。大牛角PPO在pH為7.2時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為321.33 U。

李俊等[23]測(cè)定了4個(gè)品種馬鈴薯PPO的最適pH在6.0～7.0之間，其中黑美人PPO最適pH在6.0。朱新鵬等[24]對(duì)7個(gè)品種馬鈴薯PPO在不同條件下進(jìn)行了測(cè)定，其PPO最適pH值均在5.6～6.8。其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，馬鈴薯PPO的最適pH均在同一范圍內(nèi)，為6.0～7.2。對(duì)比最適pH下5種不同馬鈴薯PPO酶活力可以看出，黃心馬鈴薯PPO酶活力最高，大白花馬鈴薯PPO酶活力最低。

2.4 反應(yīng)底物濃度對(duì)不同品種馬鈴薯PPO酶活力的影響

選擇鄰苯二酚為反應(yīng)底物，分別以不同濃度進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)得不同品種馬鈴薯PPO的酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4 不同品種馬鈴薯PPO在不同底物濃度下酶活力Fig.4 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes under different substrate concentrations

由圖4可知，隨著底物鄰苯二酚濃度的增加，酶促反應(yīng)速率隨著底物濃度的增加逐漸加快，5個(gè)品種馬鈴薯PPO酶活力顯著增高，當(dāng)鄰苯二酚達(dá)到一定濃度時(shí)，酶活力隨著濃度的增加而趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)镻PO與底物鄰苯二酚結(jié)合達(dá)到飽和[25]。

在達(dá)到最適底物濃度后，PPO酶活力大小依次為：大牛角PPO(473.33 U)>紅玫瑰PPO(432.67 U)>黃心PPO(401.33 U)>黑美人PPO(384.67 U)>大白花PPO(295.33 U)。大白花酶活力最低，與前面反應(yīng)溫度和pH結(jié)果一致。

2.5 不同品種馬鈴薯PPO對(duì)酶促制備茶黃素類物質(zhì)生成量的影響

對(duì)5個(gè)品種馬鈴薯PPO進(jìn)行酶促制備茶黃素類物質(zhì)，結(jié)果見圖5。

圖5 不同品種馬鈴薯PPO酶促制備茶黃素類物質(zhì)生成量Fig.5 Production amount of theaflavins prepared by enzymatic reaction of PPO from different varieties of potatoes

由圖5可知，在茶黃素4個(gè)單體生成中，TF的生成量最多，其次是TFDG，再次是TF-3-G和TF-3'-G。由此可以看出，馬鈴薯PPO催化兒茶素類物質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)化為茶黃素單體的合成量存在差異，即對(duì)TF和TFDG的轉(zhuǎn)化具有一定程度的定向性，對(duì)該兩種茶黃素單體的酶促合成存在一定的優(yōu)勢(shì)。

經(jīng)SPSS顯著性差異分析，不同品種馬鈴薯PPO對(duì)TFs生成量存在顯著性差異。黃心馬鈴薯PPO對(duì)TFs的生成量最高，為129.71 μg/mL。大白花馬鈴薯PPO對(duì)TFs的生成量最低，約為黃心馬鈴薯PPO對(duì)TFs生成量的一半。

不同品種馬鈴薯對(duì)4種茶黃素單體的生成量也存在顯著性差異。黃心馬鈴薯PPO對(duì)酶促生成4種茶黃素單體均顯著高于其他品種。黃心PPO、大牛角PPO和紅玫瑰PPO對(duì)TF-3-G的生成量較高(25.61，22.71，22.15 μg/mL)，大白花PPO對(duì)TFDG的生成量最低，為18.66 μg/mL。

3 討論

3.1 馬鈴薯PPO酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)合成茶黃素的影響

改變溫度能夠帶來酶蛋白活動(dòng)中心結(jié)構(gòu)的變化，酶活力的喪失來自于蛋白空間構(gòu)型的改變[26]。馬鈴薯PPO在30～40 ℃范圍內(nèi)保持較高酶活力，說明在此范圍內(nèi)僅有部分PPO構(gòu)型發(fā)生改變，酶活力保持在較高水平。在最適溫度下，分子動(dòng)能最大，酶活性最強(qiáng)，但隨著溫度的升高，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致酶活性喪失。茶黃素的生成及在PPO的分離過程中，溫度是重要的因素之一。溫度的變化能對(duì)PPO活性進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響茶黃素生成的品質(zhì)[27]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同品種馬鈴薯PPO最適反應(yīng)溫度在30～40 ℃。Li等[28]對(duì)馬鈴薯PPO酶促合成TFs進(jìn)行了條件優(yōu)化，可知馬鈴薯PPO酶促制備TFs的最適溫度為30 ℃，在馬鈴薯PPO最適溫度范圍內(nèi)，說明在馬鈴薯PPO最適溫度下，PPO活性較為適宜，其PPO的活性利于TFs的生成，不會(huì)導(dǎo)致茶褐素的生成。

不同品種PPO最適pH也有一定的差別，但最適pH范圍在6.0～7.2之間，其酸堿環(huán)境為弱酸性和中性。這是因?yàn)镻PO酶活性中心具有Cu2+，在強(qiáng)酸性條件下Cu2+易發(fā)生解離，使PPO酶活性降低；在強(qiáng)堿性條件下Cu2+解離后極易生成氫氧化銅沉淀，使酶活性大幅度降低[29]。PPO酶活力會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)pH影響酶活性中心和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而改變。有分析表明在偏酸性條件下更有利于茶黃素的形成，并且在酸性環(huán)境下茶黃素更加穩(wěn)定[30]。通過得出馬鈴薯PPO的最適pH為偏酸和中性，為后續(xù)從PPO合成TFs提供了適宜酸堿環(huán)境，從而在合成TFs過程中易保持較高的酶活性。

本研究以鄰苯二酚作為反應(yīng)底物，通過改變濃度得出不同品種馬鈴薯PPO的最適反應(yīng)濃度，不同品種PPO最適反應(yīng)濃度不同，這是因?yàn)椴煌贩NPPO對(duì)底物的親和力不同，其底物的親和力與酶源的構(gòu)成有關(guān)。有研究表明[31]，PPO對(duì)多種二酚類物質(zhì)均具有催化作用，其中在鄰苯二酚作為底物時(shí)，能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。PPO與底物結(jié)合能力的差異是通過酶活力的差異來表現(xiàn)的，在酶促氧化合成茶黃素時(shí)，茶多酚中含有一定量的酚類物質(zhì)與PPO發(fā)生反應(yīng)，PPO的底物專一性和底物濃度會(huì)在不同程度上影響其酶活性，從而影響茶黃素的酶促合成。

酶分子因能夠增大化學(xué)反應(yīng)效率而常用來作催化反應(yīng)的催化劑，它也是酶促反應(yīng)的原動(dòng)力，其酶促反應(yīng)效率可用PPO酶活力來表示。研究表明[32-33]，高酶蛋白和酶活力對(duì)酶促制備茶黃素具有高催化作用。黃心馬鈴薯、大牛角馬鈴薯、紅玫瑰馬鈴薯3種PPO表現(xiàn)出高酶活力和高酶蛋白，是接下來篩選合成茶黃素PPO最適品種的重點(diǎn)，同時(shí)為后續(xù)驗(yàn)證PPO酶活力是否與酶促合成TFs的能力呈現(xiàn)正相關(guān)提供了思路。

3.2 不同馬鈴薯PPO對(duì)酶促合成茶黃素的影響

不同品種馬鈴薯PPO酶促合成TFs及各茶黃素單體的能力存在差異。通過前面不同品種PPO酶學(xué)性質(zhì)的對(duì)比可知，一般情況下酶活力高的其酶促合成能力強(qiáng)，但酶蛋白含量也與茶黃素合成能力有關(guān)。有研究指出茶黃素合成量除與酶活性呈正相關(guān)外[34]，還與PPO同工酶的組成有關(guān)。在多條同工酶譜帶共同作用下，PPO能催化兒茶素合成茶黃素。PPO在馬鈴薯的組織器官中普遍存在[35]，Thygesen等為研究馬鈴薯PPO酶活力的變化規(guī)律，對(duì)馬鈴薯生長過程中塊莖、葉片等在不同時(shí)期的PPO進(jìn)行了酶活力測(cè)定與同工酶譜帶檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PPO酶活力和同工酶數(shù)量均表現(xiàn)出時(shí)空特異性，隨著植物生長時(shí)期的變化而變化，這是造成不同品種馬鈴薯PPO酶活力及酶促合成茶黃素生成量不同的重要原因，而同工酶對(duì)其茶黃素合成具體的影響還需繼續(xù)深入研究。

在馬鈴薯中，編碼PPO的核基因至少有6個(gè)，PPO活性中心的銅離子結(jié)合區(qū)具有兩個(gè)構(gòu)象Cu A和Cu B，其具有高度同源性。酶促反應(yīng)合成是因銅離子與多酚類物質(zhì)結(jié)合并靠近活性中心，使分子結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因排列發(fā)生改變而存在[36]。酶活性中心結(jié)構(gòu)的多樣性賦予了PPO底物特異性，PPO與底物之間的作用取決于活性中心附近的氨基酸，品種的不同造成氨基酸的不同，從而影響不同品種馬鈴薯PPO生成茶黃素的種類和合成量不同。

4 結(jié)論

通過5個(gè)品種馬鈴薯PPO結(jié)合酶學(xué)性質(zhì)和酶促制備茶黃素能力的對(duì)比，篩選出最適生成茶黃素的馬鈴薯PPO品種為黃心馬鈴薯。證實(shí)茶黃素的生成量不僅與酶活力呈正相關(guān)，還與酶含量有關(guān)，PPO酶含量也決定著兒茶素催化茶黃素的能力。相較于其他4個(gè)品種PPO而言，黃心馬鈴薯PPO粗酶的最適反應(yīng)溫度和pH相對(duì)較低，利于茶色素的生成和保留。在測(cè)定其酶活力時(shí)選擇鄰苯二酚作為底物，黃心馬鈴薯PPO的最適底物濃度為50 mmol/L，為后續(xù)分離純化PPO時(shí)測(cè)定酶活力提供了條件。本文對(duì)不同品種馬鈴薯PPO的酶學(xué)性質(zhì)及酶促制備茶黃素的能力進(jìn)行了對(duì)比研究，有利于更好地對(duì)酶活性進(jìn)行調(diào)控，從而為馬鈴薯PPO的分離純化及茶黃素制備提供理論依據(jù)。