姜黃素與蛋白質相互作用研究進展

甘傳發，郭金英，白周亞

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

姜黃素是從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的一種多酚類物質，是植物界很稀少的具有二酮的酮類化合物[1]。姜黃素是世界上銷量最大的天然食用色素之一，是世界衛生組織和美國食品藥品管理局等準許使用的食品添加劑[2]。姜黃素不僅是一種非甾體類抗炎藥物，而且對疾病具有廣泛的預防特性[3]。

現代醫學研究發現人體眾多疾病的發生與自由基形成、炎癥反應的參與有關，姜黃素抗氧化活性和抗炎作用已引起國內外學者的廣泛關注[4]。姜黃素還具備抗氧化、抗凝血、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物活性，且毒性低，廣泛應用于食品加工與醫療行業[5-6]。研究表明,姜黃素作為一種食品添加劑，具有多種藥理活性和生物活性，而且姜黃素的毒副作用小，功能多樣且強大，這些都表明姜黃素在未來的應用前景非常廣闊[7]。但姜黃素水溶性差，在體外易被氧化，且溶解度低、代謝快，導致生物利用度低，限制了姜黃素的深入利用[8]。

多酚類物質與蛋白質的相互作用是小分子化合物與生物大分子相互作用領域中研究的熱點。本文介紹了姜黃素與蛋白質相互作用對姜黃素理化性質的影響，探討了姜黃素與蛋白質相互作用機理及影響因素，分析了姜黃素與蛋白質相互作用的分析技術，以期為姜黃素和蛋白質相互作用研究提供理論依據和方法，為姜黃素的利用提供參考。

1 姜黃素與蛋白質相互作用對姜黃素理化性質的影響

姜黃素是一種具備多種生物活性，且極有利用價值的脂溶性多酚，但遇光容易分解，不耐熱，溶出速率慢，在腸道的堿性環境中不穩定，難以被機體吸收利用，從而限制了姜黃素的生物利用度[9]，進而極大限制了姜黃素在食品工業中的應用及活性功能的體內發揮[10]。攻克姜黃素理化性質的缺點、充分利用姜黃素的生物活性成為現階段研究的熱點。

由于姜黃素溶解度較低、溶出速率慢,極大限制了其藥理作用，提高姜黃素的溶解度就可能提升其生物利用率，從而最大程度發揮姜黃素的生物活性。Moghadam等[11]研究發現姜黃素與核桃蛋白形成絡合物后，不僅對核桃蛋白的化學結構沒有明顯影響，而且改善了姜黃素的溶解度，這是因為核桃蛋白分子包封姜黃素分子使其溶出速率變快，可以更好地利用姜黃素的抗氧化活性。這與Vijayan等[12]的研究相似，他們利用豌豆分離蛋白和乳清分離蛋白復配后再與姜黃素絡合，形成的絡合物不僅能更好地保護姜黃素，而且解決了姜黃素水溶性差和生物可及性有限的問題，使得姜黃素具有較好的溶解度。同樣有研究表明姜黃素能與大豆分離蛋白通過疏水作用絡合形成穩定的復合物，使姜黃素的水溶性增加，同時會提高其在胃液和腸液中的穩定性，為腸道吸收提供足夠的時間，大大提高了姜黃素的生物利用率[13]。這一結果說明姜黃素的穩定性同樣能影響其生物活性的發揮，正如Okagu等[14]利用姜黃素與琥珀酰化蛋白絡合形成穩定的復合物，結果表明反應形成的復合物能保護姜黃素，增強了姜黃素在胃期間的穩定性，使其有充足的時間被吸收利用[15]。這一結果同樣也被Wang等[16]發現，姜黃素與蛋清分離蛋白形成的復合物在一定程度上可以保持姜黃素的穩定性，保護姜黃素不被熱降解，進而提高姜黃素的保留率。出現這種情況可能是因為姜黃素與蛋白質結合后導致蛋白質的非極性基團暴露而誘導蛋白質變性，使復合物更加穩定[17]，這樣更有利于姜黃素的充分利用。這也說明溫度能影響姜黃素和蛋白質相互作用，從而改善姜黃素的穩定性和溶解度，進而提高生物利用率。此外，研究表明蛋白質的結構同樣可以改進姜黃素的穩定性和溶解性。Solghi等[18]將姜黃素包封在乳清蛋白分離物中，形成穩定的球形復合物，能將姜黃素的氧化穩定性從10%提高到70%，這是提高姜黃素生物利用度的有效途徑[19]，使得姜黃素的生物活性得到最大的運用。這是因為球形的復合物可以使其接觸面積更大，有益于它的溶解，而球形具有更穩定的結構，可以提升穩定性。這與Cai等[20]的研究非常相似，他們制備了太子參蛋白-姜黃素納米復合物，因所制得的復合物具有均勻的球形結構，使得復合物擁有良好的穩定性，不但改進了姜黃素的穩定性和抗氧化性，而且有助于細胞吸收。總的來說，蛋白質可以與姜黃素相互作用而改善其溶解度、穩定性以及生物可及性，而外部環境也會影響兩者相互作用，如溫度、蛋白質結構等。

2 姜黃素與蛋白質相互作用機理及影響因素

2.1 姜黃素與蛋白質相互作用機理

姜黃素與蛋白質的相互作用主要是通過氫鍵、疏水作用力、范德華力、靜電引力等非共價鍵作用發生的可逆性結合，在結合過程中往往會伴隨對蛋白固有熒光的猝滅機理。氫鍵和疏水作用力是姜黃素與蛋白質之間的主要作用力，而范德華力和靜電引力次之。Ying等[21]研究發現姜黃素與胃蛋白酶之間會相互作用，導致胃蛋白酶熒光產生靜態猝滅機制，而熱力學參數表明除氫鍵外，疏水作用在穩定姜黃素-胃蛋白酶復合物中也起著重要作用。相似的結果也被Yi等發現，他們利用熒光實驗證實了姜黃素與乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合物之間的自發相互作用主要是由疏水作用和氫鍵引起的。除此之外，姜黃素與蛋白質間可能會有其他作用力，如范德華力、靜電引力等。陳寧生等[22]用光譜法研究姜黃素與牛血清白蛋白的作用機理，先測定出兩者的結合常數，再由結合反應的焓變和熵變推測范德華力和氫鍵是主要的內在結合力。路東亮等[23]也證實了姜黃素與牛血清白蛋白主要以氫鍵和范德華力相結合，同樣也造成蛋白熒光的靜態猝滅。目前研究發現，盡管研究材料相同，但如果改變了反應體系的環境，會發現姜黃素與蛋白質間相互作用機理不同。張曉星等[24]在堿性條件下通過反應前后熱力學變化分析姜黃素與牛血清白蛋白的作用機理，得出反應體系中主要作用力是靜電引力。趙悅等[25]通過多種熒光光譜結合電化學法，發現姜黃素與牛血清白蛋白的相互作用是自發的疏水作用。這些結果表明，不同的蛋白質與姜黃素之間作用機理不盡相同，相同蛋白也會因不同環境和不同研究方式而呈現出新的作用機理。隨著科學技術的發展，越來越多的分析技術用于研究姜黃素與蛋白質相互作用，會發現更多作用機理。

2.2 影響因素

目前對影響姜黃素與蛋白質相互作用的主要因素的研究主要包括反應體系濃度比[26]、溫度[27]、pH[28]、蛋白質結構和動能[29]、超聲[30]等。不同濃度比會產生不同的效應，王晶晶等[31]研究姜黃素與豬脂肪氧化酶相互作用對蛋白質結構的影響，結果表明，姜黃素濃度越高，對脂肪氧化酶的抑制作用越強，反之則抑制作用越弱。類似的結果被Zhan等[32]發現，通過親水性乳清蛋白分離物與疏水性玉米蛋白制備蛋白基復合納米顆粒包封姜黃素，當改變兩種蛋白的質量比時，姜黃素的溶解度也隨之改變。這些結果表明，反應體系中濃度比對兩者相互作用影響較大，同樣，反應體系的物質狀態也會影響姜黃素與蛋白質相互作用，Ye等[33]證實了通過噴霧干燥后，姜黃素-乳清蛋白分離物的絡合被增強，使得干燥后未結合的姜黃素含量降低，比原液具有更好的水溶性、穩定性和生物可及性，進而提高了生物利用率。反應體系的環境同樣會影響兩者之間的相互作用，而最為典型的環境變化就是體系中pH值的變化。Wang等[34]以豬血漿蛋白為載體通過pH漂移法提高姜黃素的穩定性和分散性，而隨著最終pH值的增加，姜黃素-豬血漿蛋白復合物的穩定性提高，且結合復合物的抗氧化性與天然姜黃素相當。不同蛋白質會呈現不同的結構與功能，它們與姜黃素的相互作用也會不同，Peng等[35]分別利用乳清蛋白、大豆蛋白對姜黃素納米顆粒進行包覆，得出不同的最大承載能力，表明蛋白質結構與功能的不同會造成兩者相互作用的強弱不同。

3 姜黃素與蛋白質相互作用的分析技術

姜黃素與蛋白質結合方式可通過測定二者的結合常數和結合位點數、作用力類型，分析結合前后蛋白構象的變化等方式進行表征。除了紫外可見吸收光譜、熒光光譜、傅里葉紅外光譜等常規方法外，近年來圓二色性光譜法、量熱法、分子對接模擬、分子動力學等新方法正逐漸應用于分析姜黃素與蛋白質的相互作用。

3.1 紫外可見吸收光譜

紫外可見吸收光譜儀具有應用廣泛、成本低、操作簡便快速、準確度高、靈敏度高的特點。紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發生了電子能級躍遷而產生的吸收光譜，可用于探索蛋白質的結構變化和研究蛋白質小分子復合物的形成[36]。

張秋蘭等[37]運用紫外可見光譜結合計量學研究姜黃素與人血清白蛋白的相互作用，表明姜黃素可以通過π-π堆積吸附在人血清白蛋白的表面而形成復合物。Zhang等[38]通過紫外可見光譜證實了姜黃素-肌球蛋白復合物的存在，并結合穩態熒光光譜研究結果顯示姜黃素與肌球蛋白的結合具有靜態猝滅作用。

3.2 熒光光譜

蛋白固有熒光歸因于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，可以用于闡明配體與蛋白的相互作用后蛋白的猝滅機制和構象變化。熒光光譜是被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光經放大后輸出的發射光譜，其中穩態熒光光譜表明蛋白的猝滅機制，而同步熒光光譜則反映蛋白的構象變化[39]。熒光光譜可以分析多種元素，包括固體、粉末、熔珠、液體等樣品，同時它還具有靈敏度高、分析速度快、測量范圍寬、干擾小等優點，但不宜用于測定熒光持續時間較短的物質，且熒光發散不集中，強度不高。

Jahanshahtalab等[40]利用穩態熒光光譜分析α-乳清蛋白與白藜蘆醇和姜黃素的相互作用，表明α-乳清蛋白的熒光是以靜態機制進行猝滅的，兩種多酚共同作用猝滅效果更佳；并通過同步熒光光譜分析表明α-乳清蛋白的構象發生了改變。林堅濤等[41]也通過穩態熒光光譜研究發現姜黃素與牛血清白蛋白的相互作用致使蛋白熒光發生靜態猝滅。方瑞萍等[42]研究發現，隨著姜黃素濃度的增大，牛血清白蛋白中色氨酸殘基和酪氨酸殘基均表現出一定的熒光猝滅作用，色氨酸殘基猝滅較明顯。這是因為姜黃素的加入改變了色氨酸所處的微環境，使其極性減小，疏水性增加，改變了牛血清白蛋白的內部構象。熒光光譜除了包含穩態熒光光譜和同步熒光光譜外，同時還有三維熒光光譜。現階段在對多酚與蛋白質的相互作用的研究中，三維熒光光譜技術在熒光分析時得到了越來越多的應用，因其可以提供更詳細的多酚與蛋白質相互作用時構象變化的信息[43]。

3.3 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜是通過測量干涉圖和對干涉圖進行傅里葉變化的方法來測定紅外光譜。在蛋白質結構分析的常用方法中，紅外光譜有其突出的優點，它適用于不同狀態、不同濃度及不同環境中蛋白質和多肽的測定。

傅里葉變換紅外光譜往往都是與熒光光譜配合使用，共同說明蛋白質-配體復合物的形成，Razzak等[44]的熒光實驗表明，隨著姜黃素濃度的增加，蠶蛋白的固有熒光逐漸被猝滅，說明姜黃素分子與蛋白質中熒光團氨基酸殘基(Tyr和Trp)進行了分子絡合。結合傅里葉變換紅外光譜分析表明，姜黃素與蠶蛋白是通過特定的氨基酸殘基形成絡合物，從而有效抑制姜黃素的降解，使姜黃素的抗氧化活性提高30%。最終表明蠶蛋白可用于遞送水不溶性生物活性藥物。

3.4 圓二色性光譜

圓二色性光譜是以摩爾橢圓度或吸光率之差為縱坐標、波長為橫坐標所制作的曲線，可用于觀測蛋白質的二級結構變化，常被用于表征多酚與蛋白質相互作用，并估算蛋白的二級結構含量變化，如α-螺旋、β-折疊、γ-轉角和無規則卷曲[45]。圓二色性光譜儀具有樣品耗量少且數據處理量小等特征，它常常與其他技術聯用來研究小分子與蛋白質結合過程中的結構變化，如同步、三維熒光。

Mohammadi等[46]用圓二色性光譜研究姜黃素與人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的結合。根據圓二色性光譜的微小變化計算出供體(HSA和BSA)二級結構含量發生部分變化，而這兩種白蛋白的二級結構的微小變化表明配體誘導的構象變化只局限在結合位點上，并不涉及蛋白質折疊的顯著變化。鄧楚君等[47]利用圓二色性光譜分析天然和熱變性乳鐵蛋白與姜黃素的復合物，發現乳鐵蛋白的二級結構發生了不可逆的改變，說明姜黃素的添加能夠顯著改變乳鐵蛋白的二級結構。

3.5 量熱法

量熱法具有靈敏度高、重復性好的優點，可一次性測定多個結合參數，受沉淀影響小，但也有加熱效應弱、測試耗時等缺點。目前用于研究多酚與蛋白質相互作用的量熱法是差示掃描量熱法和等溫滴定量熱法。差示掃描量熱法是測量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度的關系，而等溫滴定量熱法主要用于檢測多酚與蛋白質相互作用過程中完整的熱力學參數，如結合親和力、熵、焓、比熱容以及動力學的信息等[48]。最終利用熱力學參數得出作用力類型。

劉宇佳[49]將差示掃描量熱和X射線衍射實驗聯用，發現姜黃素和卵清蛋白形成的復合體系中姜黃素的晶體結構消失，蛋白更容易受到熱分解作用，但復合體系改善了姜黃素的溶解度，提高了約370倍，表現出更好的抗氧化活性和光穩定性。研究表明，等溫滴定量熱法相比差示掃描量熱法更精確、更廣泛，現階段研究多酚與蛋白質相互作用更多的是通過等溫滴定量熱法，如Wang等[50]利用等溫滴定量熱法并結合穩態熒光光譜得出結合常數、結合位點數以及焓變和熵變，最后通過計算得出鱈魚蛋白與姜黃素的結合主要受疏水相互作用驅動，導致靜態熒光猝滅和能量釋放。

3.6 分子對接

分子對接模擬已成為研究分子間相互作用的重要手段之一，該技術是一種基于生物信息學的分析方法，其原理基于“鎖鑰模型”和“誘導契合學說”原理[51]，通過計算機軟件，建立小分子配體與蛋白質受體結構，模擬二者結合的分子行為與結構變化。分子對接技術分為三類：剛性對接、半柔性對接、柔性對接。其中半柔性對接通常用于研究小分子與蛋白質的相互作用，半柔性對接允許對接過程中小分子構象發生一定程度的變化，但通常會固定大分子的構象，這會使小分子構象的調整也可能受到一定程度的限制。

分子對接技術通常與光譜學、量熱法聯用，用于驗證光譜實驗或量熱實驗的結果。Ying等采用多光譜法和分子對接技術研究在胃的生理pH值下，姜黃素可以通過聯合猝滅過程有效地猝滅胃蛋白酶的熒光。熒光實驗表明兩者的結合主要通過疏水作用力，而圓二色性光譜和紫外可見吸收光譜研究表明，兩者的結合導致胃蛋白酶構象變化，最后通過分子對接驗證光譜實驗結果，并揭示姜黃素還可能與胃蛋白酶形成氫鍵，進一步穩定了姜黃素-胃蛋白酶復合物。類似的研究結果被Mehranfar等[52]揭示，熒光實驗研究表明姜黃素在酪蛋白分子上存在一個單獨的結合位點，具有較高的親和力，而且酪蛋白的熒光猝滅可能是靜態猝滅機制。分子對接研究結果表明，姜黃素可能在疏水核心與酪蛋白結合，并進一步驗證熒光實驗結果。

3.7 分子動力學

分子動力學主要是依靠牛頓力學來模擬分子體系的運動，在由分子體系的不同狀態構成的系統中抽取樣本，從而計算體系的構型積分，并以構型積分的結果為基礎進一步計算體系的熱力學量和其他宏觀性質[53]。

通常將分子動力學與光譜學或者分子對接結合使用。Zhang等基于光譜技術研究姜黃素與肌球蛋白相互作用的分子動力學模擬，通過分子動力學觀察并結合圓二色性光譜研究表明，姜黃素與肌球蛋白的相互作用使蛋白的二級結構發生了輕微的變化。而且通過分子動力學模擬技術觀察到疏水作用和氫鍵促進了姜黃素-肌球蛋白復合物的形成。張天一等[54]則是運用分子對接和分子動力學模擬的方式，對姜黃素與高危型人乳頭瘤病毒的E6蛋白相互結合模式研究發現E6蛋白與姜黃素可以通過疏水作用特異性結合而形成復合物。

姜黃素與蛋白質的相互作用復雜，需要多種研究方法的結合使用。光譜學、量熱學、分子模擬等的發展，為我們研究姜黃素與蛋白質相互作用提供了有力的技術保障。除此之外，研究多酚與蛋白質相互作用的方法還有很多，如高效液相色譜、核磁共振波譜、拉曼光譜等，但這些方法是否可以用于研究姜黃素與蛋白質相互作用中還有待探討。

4 結論與展望

目前研究表明，對于研究姜黃素與蛋白質相互作用來改善姜黃素水溶性差、代謝快、熱穩定性差等理化性質造成其生物利用率較低方面取得了一定的成效，但兩者間相互作用的具體機制尚不明確。另外，分子間相互作用會受到諸多因素的影響，不僅要注意反應體系環境中的影響因素，更要考慮在機體消化環境下姜黃素與蛋白質、消化酶之間存在的各種競爭相互作用關系，而這種競爭相互作用關系是否會影響機體消化吸收及姜黃素生物活性尚不清楚。此外，雖然姜黃素與蛋白質之間相互作用的分析技術較多，但往往只是選擇部分技術用于研究，所以建立穩定可靠的研究方式是必然趨勢。

因此，今后的研究方向可以從以下兩個方面進行探討：一方面，可以借助更多的分析技術方法，如生物信息學、分子生物學等技術，采用多種分析技術聯用的方法研究姜黃素與蛋白質之間的相互作用，更全面地揭示兩者間交互作用機制，為進一步闡明姜黃素的生物活性機制提供基礎。另一方面，研究人員進一步研究姜黃素在機體內與不同蛋白的結合特性，進而明確機體內各種蛋白與姜黃素的交互作用機制，從而為改善姜黃素生物利用率和生物活性的表達提供理論條件。