響應面優化HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌揮發性風味物質

郭磊，李為蘭，魯斌，王德新，劉云，王軍民

(1.西南林業大學 云南省高校大健康類森林資源開發利用工程研究中心,昆明 650224;2.西南林業大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室,昆明 650224)

揮發性風味物質是食用菌的重要感官指標,也是評價其成熟度、加工方式及品質的重要指標,主要包括八碳化合物、含硫化合物、醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等[1-2]。八碳化合物和含硫化合物因含量豐富且識別閾值低,對風味品質的影響較大,故被公認為是食用菌中的特征揮發性風味物質[3]。揮發性八碳化合物是食用菌中最重要的風味物質,具有濃郁的蘑菇味,最具代表性的是1-辛烯-3-醇[4]。揮發性含硫化合物是構成食用菌中風味物質的另一種重要化合物,能夠影響食用菌的整體風味。Morita等[5]最早從香菇中分離出1,2,3,5,6-五硫雜環庚烷(香菇素, lenthionine),被認為是香菇最重要的揮發性含硫化合物。之后,越來越多的揮發性含硫化合物從食用菌中被檢測出來,包括硫醚類、硫醇類和含硫雜環化合物等。醛類、酮類、酸類、酯類及其他雜環類化合物也呈現出食用菌的特殊香味[6]。復合調味料是一種兼具天然、便利、營養及風味等特點的新型產品,在我國的生產和應用歷史非常悠久,一款營養價值高、色香味俱佳的復合調味料會越來越受到人們的歡迎[7-8]。因此,分析揮發性風味物質并研究其在不同食品加工過程中的變化規律,不僅可以在食用菌加工過程中進行風味品質控制,還可以促進食用菌產業特別是復合調味品產業的開發升級。

目 前,食品中揮發性風味物質的提取方法主要有頂空分析法(HS)、固相微萃取法(SPME)、同時蒸餾萃取法(SDE)、超臨界CO2流體萃取法等[9],其中,HS-SPME集采樣、萃取、濃縮及樣品導入于一體,具有高效快速、靈敏度高、易于自動化等優點[10],在食用菌[11]、醋[12]及醬料[13]等食品工業中有著十分廣泛的應用。美味牛肝菌(BoletusedulisBull.)屬于擔子菌門、層菌綱、牛肝菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬[14]。中國是美味牛肝菌的主產區,主要分布于西南和東北森林資源富集區,以西南地區的種類最豐富,而云南產量最大[15-16]。新鮮美味牛肝菌含水量高、呼吸作用強,易發生褐變、萎蔫等現象，導致商品價值降低,干燥能夠降低美味牛肝菌中的水分含量,抑制酶的活性及微生物的生長繁殖,從而延長貨架期[17]。然而,不同干燥方法對美味牛肝菌干制品中揮發性風味物質的影響不同。本研究在單因素試驗結果的基礎上,采用響應面法優化美味牛肝菌揮發性風味物質的頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)條件,并結合氣質聯用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分別對恒溫干燥、真空干燥及真空冷凍干燥后美味牛肝菌傘部、桿部的揮發性風味物質進行分析,比較3種干燥方式對美味牛肝菌揮發性風味物質的影響,以期為美味牛肝菌資源的綜合利用及其調味品研發提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮美味牛肝菌:2021年7月購自昆明市木水花食用菌交易市場。新鮮美味牛肝菌經挑選、清洗后擦干,將傘部、柄部分別切成1 cm的薄片,分別置于70 ℃恒溫干燥、70 ℃真空干燥及真空冷凍干燥至恒重,粉碎過篩后備用。

BSA224S電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;FreeZone?(Plus) 4.5 L冷凍干燥機 美國Labconco公司;RCH-1000頂空固相微萃取裝置 上海愛朗儀器有限公司;7890B氣質聯用儀 美國Agilent公司;57328-U型50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 萃取頭使用

初次使用萃取頭時需在GC進樣口以270 ℃老化2 h,以后使用前將萃取頭在270 ℃活化30 min后即可。相同條件下做數次空白直至無干擾峰出現。

1.2.2 HS-SPME條件

精確稱取不同部位美味牛肝菌樣品(0.500 g)于20 mL棕色頂空瓶中,迅速將已老化好的萃取頭插入頂空瓶中進行吸附,待吸附結束后迅速將萃取頭拔出并插入到進樣口進行解吸和檢測。

圖2為污水流速對水側換熱系數的影響.從圖上可知，污水流速為0.2 m/s對水側換熱系數的影響很大，換熱系數由4 368增大到5 545 W/m2·K，增大約27%，而后當污水流速再增大到0.25 m/s，水側換熱系數約6 048 W/m2·K，增大為僅9%.說明從0.2 m/s后，污水速度提高對水側換熱系數影響趨勢不太明顯.

1.2.3 GC-MS分析

GC-MS條件:HP-5MS 揮發性色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣(He)流速為1.0 mL/min;升溫程序:初始溫度40 ℃并保持5 min,然后以5 ℃/min升溫至260 ℃保持2 min;不分流模式進樣;進樣口溫度為250 ℃。質譜條件:EI源,70 eV,傳輸線溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描方式為全掃描,質量掃描范圍30～400 m/z。

檢測后經NIST Library 14.0譜庫檢索,并結合相關文獻確定其成分組成,采用相似度大于80(最大值100)的檢測結果。

1.2.4 單因素試驗

在前期預試驗的基礎上,選擇解吸時間15 min,單因素試驗如下:固定萃取時間30 min、平衡時間20 min,研究不同溫度(70,75,80,85,90 ℃)對揮發性風味物質萃取效果的影響;固定萃取溫度80 ℃、平衡時間20 min,研究不同萃取時間(20,25,30,35,40 min)對揮發性風味物質萃取效果的影響;固定萃取溫度80 ℃、萃取時間20 min,研究不同平衡時間(10,15,20,25,30 min)對揮發性風味物質萃取效果的影響。

1.2.5 響應面設計

根據Box-Behnken試驗中心組合設計的原理,選擇萃取溫度、萃取時間及平衡時間為影響因素,各因素及水平表見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.6 數據處理

每個試驗均重復3次，響應面試驗結果采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗優化

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Design and results of response surface test

利用軟件Design Expert 8.0.6對試驗所得數據進行多元回歸分析,獲得美味牛肝菌揮發性風味物質對萃取溫度(A)、萃取時間(B) 及平衡時間(C)的二次多項回歸模型,回歸方程為Y=29.40-0.87A-1.50B-0.88C+AB-1.25AC+1.50BC-3.08A2-1.83B2-2.07C2。

對回歸模型及各因素進行方差分析,結果見表3。

表3 響應面試驗回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation ofresponse surface test

續 表

由表3可知,模型的P值<0.000 1,說明回歸模型極顯著(P<0.01),而失擬項的P=0.367 8,不顯著(P>0.05),表明回歸方程擬合度良好。模型決定系數R2=0.981 4,RAdj2=0.957 5,表明回歸方程與實際值具有高度擬合性,可以用此模型來對HS-SPME-GC-MS法萃取美味牛肝菌的揮發性風味物質進行分析和預測。另外,模型中的一次項A、B、C,交互項AC、BC及二次項A2、B2、C2對揮發性風味物質萃取效果的影響極顯著(P<0.01),交互項AB對萃取效果的影響顯著(P<0.05)。3個因素對揮發性風味物質峰數(Y)影響效果的主次順序依次為萃取時間(B)>萃取溫度(A)=平衡時間(C),因素兩兩交互作用的響應面結果見圖1。

圖1 萃取溫度、萃取時間、平衡時間兩兩交互作用對揮發性風味物質萃取效果的影響Fig.1 Effects of interaction of extraction temperature, extraction time and equilibrium time on extraction effect of volatile flavor substances

對回歸模型進行預測得到HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌揮發性物質的最佳條件為萃取溫度79.05 ℃、萃取時間27.88 min、平衡時間23.42 min，預測美味牛肝菌揮發性物質峰個數為30.04個。

2.2 模型驗證

根據實際條件對響應面試驗模型進行修正并驗證，選擇萃取溫度79 ℃、萃取時間28 min及平衡時間23 min，在此條件下最終得出美味牛肝菌傘部揮發性風味物質共31種，與預測值相差0.03%，表明此數學模型有著良好的預測性和準確性。

2.3 美味牛肝菌揮發性風味物質分析

采用最優的HS-SPME條件分別對70 ℃恒溫干燥、70 ℃真空干燥及真空冷凍干燥后傘部、柄部揮發性風味物質進行GC-MS分析，經80%以上相似度篩選，結果見表4。

表4 不同干燥條件下美味牛肝菌傘部、柄部揮發性風味物質Table 4 The volatile flavor substances of pileuses and stipes of Boletus edulis Bull. under different drying conditions

續 表

由表4可知,通過HS-SPME-GC-MS技術共鑒定出揮發性風味物質51種,其中醇類10種,醛類13種,酮類13種,酸類1種,酯類5種,含硫、含氮及雜環類化合物8種,烯類1種。對不同部位的揮發性風味物質分析后發現,傘部共檢測出43 種化合物,其中醇類9種,醛類11種,酮類11種,酸類1種,酯類3種,含硫、含氮及雜環類化合物7種,烯類1種。柄部共檢測出40種化合物,其中醇類7種,醛類12種,酮類11種,酸類1種,酯類3種,含硫、含氮及雜環類化合物6種。

通過比較3種不同方法干燥的美味牛肝菌傘部及柄部揮發性風味物質發現,真空冷凍干燥方法無論是種類還是峰面積都是最好的,傘部有31種揮發性風味物質,峰面積為17.83×106;柄部有27種揮發性風味物質,峰面積為16.72×106。恒溫干燥法鑒定出傘部有26種揮發性風味物質,峰面積為8.29×106;柄部有26種揮發性風味物質,峰面積為13.90×106。真空恒溫干燥鑒定出傘部有22種揮發性風味物質,峰面積為13.28×106;柄部有20種揮發性風味物質,峰面積為9.37×106。

2.3.1 醇類化合物

醇類化合物在新鮮食用菌中含量非常豐富, 但因其揮發性強、穩定性差, 在加熱過程中會造成一定的損失[18]。3種不同干燥方法共鑒定出醇類化合物13種,其中傘部有11種,柄部有9種。真空冷凍干燥后鑒定出的醇類化合物有10種,恒溫干燥后鑒定出醇類化合物有8種,真空干燥后醇類化合物數量明顯減少,只有2種。峰面積最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇、橙花叔醇、苯乙醇、3-苯丙醇、正辛醇、1-壬醇、乙醇、正己醇、正戊醇。

2.3.2 醛類、酮類化合物

醛類、酮類是食用菌中較為豐富的揮發性風味物質,C5～C9醛類具有脂香氣味,酮類具有濃郁花果香氣[19-20]。3種不同干燥后的樣品共鑒定出醛類13種,酮類13種,其中70 ℃恒溫干燥后柄部醛類物質最多,共11種,70 ℃真空干燥后傘部、柄部醛類物質最少,均為7種。6種樣品中,異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、苯甲醛及苯乙醛是共有的醛類,其中異戊醛峰面積最大,其次是苯甲醛、苯乙醛、2-甲基丁醛和異丁醛。異戊醛存在于巧克力、可可、咖啡等食品中,廣泛用于食用香精的配方中[21-22]。

在檢測出的酮類化合物中,2,3-戊二酮和2-十一酮是共有的酮類,且以2-十一酮的峰面積最大。2,3-戊二酮是一種奶香型香料,廣泛用于食用香料的制備[23]。2-十一酮具有柑橘類、油脂和蕓香香氣,存在于云香草、椰子油和棕櫚油中[24]。

2.3.3 酸類、酯類化合物

酸類一般具有腥臭味,對風味具有不良的影響[25],通過對3種不同方式干燥后的傘部和柄部都發現含有乙酸。酯類多具有水果和陳酒的香味,對風味的貢獻較大[26]。真空冷凍干燥后的傘部有3種酯類,包括丙烯酸正丁酯、甲酸辛酯和異丁酸-3-苯基丙酯,70 ℃真空干燥柄部有3,7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯和亞油酸乙酯,其他干燥后的不同部位含酯類物質很少。

2.3.4 其他

除了醇類、醛酮類、酸類及酯類化合物外,不同方式干燥后的美味牛肝菌中還鑒別出含硫化合物、含氮化合物、雜環類化合物及月桂烯等。含硫化合物包括甲硫醇、甲硫醚、3-甲硫基丙醛,含氮化合物包括2-乙酰基吡咯,雜環類化合物包括2-戊基呋喃、2-甲基四氫呋喃-3-酮、呋喃酮及異雪松醇。

2.3.5 八碳化合物和含硫化合物

八碳化合物是食用菌最重要的風味物質,主要有1-辛烯-3-醇(蘑菇醇)、1-辛醇-3-酮、3-辛酮、3-辛醇及1-辛醇等[27]。由表4可知,不同方式干燥后美味牛肝菌傘部和柄部共檢測出的八碳化合物有7種,包括1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯-1-醇、正辛醇、1-辛烯-3-酮、3-辛酮、3-辛烯-2-酮、仲辛酮,其中醇類3種,酮類4種。峰面積最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇。Murahashi最早在1938 年發現了松茸(Tricholomamatsutake)中的1-辛烯-3-醇,并將其命名為松茸醇,目前,幾乎在所有的食用菌中都發現了1-辛烯-3-醇[28]。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、濕木頭、泥土的氣息[29],在真空冷凍干燥后傘部的相對含量最大,可達25.49%。反-2-辛烯-1-醇也具有蘑菇味[30],在真空冷凍干燥后的傘部、恒溫干燥后的柄部及真空干燥后的傘部被鑒定出來。

含硫化合物對食用菌整體的芳香氣味而言舉足輕重,并且是香菇中非常重要的香味來源。然而,關于不同干燥方式對美味牛肝菌不同部位含硫化合物的影響還未見報道。通過對干燥后美味牛肝菌不同部位進行分析,共鑒定出3種含硫化合物,分別是甲硫醇、甲硫醚和3-甲硫基丙醛,其中以3-甲硫基丙醛的峰面積最大。3-甲硫基丙醛具有濃烈洋蔥、肉及烤馬鈴薯的香氣,低濃度時呈愉快的濃郁的肉香味,在香料工業中應用十分普遍[31]。甲硫醇是重要的有機化工原料,也是我國允許使用的食用香料。

3 結語

在單因素試驗結果的基礎上,通過HS-SPME-GC-MS聯用技術結合響應面優化得到美味牛肝菌中揮發性風味物質的萃取條件為萃取溫度79 ℃、萃取時間28 min、平衡時間23 min,在此條件下檢測出真空冷凍干燥后美味牛肝菌傘部揮發性風味物質共31種,驗證試驗結果表明,利用HS-SPME-GC-MS 技術萃取美味牛肝菌中揮發性風味物質的方法可靠性高。對美味牛肝菌不同干燥方式處理后的傘部、柄部揮發性風味物質進行分析發現,匹配度大于80的揮發性風味物質共51種,其中醇類10種,醛類13種,酮類13種,酸類1種,酯類5種,含硫含氮及雜環類化合物8種,烯類1種。不同干燥方式對美味牛肝菌傘部、柄部揮發性風味物質的影響也不同,就傘部而言,真空冷凍干燥后鑒定出的揮發性風味物質有31種,峰面積為17.83×106,均遠高于70 ℃恒溫干燥(峰數26個,峰面積8.29×106)和70 ℃真空干燥(峰數22個,峰面積13.28×106)。對柄部而言,真空冷凍干燥后揮發性風味物質有27種,峰面積為16.72×106,也高于70 ℃恒溫干燥(峰數26個,峰面積13.90×106)和70 ℃真空干燥(峰數20個,峰面積9.37×106)。總之,真空冷凍干燥處理能夠較好保存美味牛肝菌的揮發性風味物質。云南有豐富的美味牛肝菌資源和廣闊的消費市場,后期試驗還需進一步研究其他干燥方式及干燥條件對美味牛肝菌揮發性風味物質的影響,通過對比分析以期獲得美味牛肝菌更為經濟適用的干燥方式。

綜上所述,不同干制方法下美味牛肝菌傘部、柄部揮發性風味物質的組成及含量有著較大的差異,也代表著不同的食品風味。以營養豐富、風味獨特的美味牛肝菌為原料,采用不同干制方法制備的調味料及復合調味料也一定會成為食用菌調味料的研發熱點,有著廣闊的市場發展前景。