香菇醬油制曲工藝的優(yōu)化

趙楊楊，于貞

(煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

香菇又名香蕈、香信，栽培歷史悠久，最早的剁花種菇法距今已經(jīng)有 800 多年[1]。香菇是最常見的一種可食用真菌，其含有豐富的呈味氨基酸和核苷酸,賦予了香菇獨特的鮮味[2]， 在日常烹調(diào)中它也可以替代味精,在菜肴中起到提鮮的作用。香菇中還含有香菇多糖[3]、嘌呤[4]、多酚[5]等生物活性物質(zhì)，因此香菇具有一定的抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8-9]、降血脂[10]等生理功能。

醬油是烹飪中不可缺少的一類調(diào)味品，最初人們對醬油的要求為滿足簡單調(diào)味、上色即可，但隨著生活水平的提高以及消費觀念的轉(zhuǎn)變，人們更加注重醬油口感和營養(yǎng)價值的豐富性[11]。這使得醬油向功能型醬油的方向發(fā)展，因此眾多提高醬油營養(yǎng)價值的功能型醬油面向市場。香菇味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，利用香菇進行醬油的釀造不僅使醬油具備了香菇的濃郁鮮味，而且增加了醬油的生物活性成分，為人們提供了更高質(zhì)量、更美味的醬油產(chǎn)品[12]。目前市售的大部分香菇醬油都是以香菇提取液為原料，加入到醬油中調(diào)配而成的。此方法雖然對提高醬油鮮味有所幫助，但并不能使香菇中營養(yǎng)物質(zhì)和鮮味物質(zhì)完全降解，充分溶解到醬油中，對于醬油品質(zhì)沒有很大的改觀。只有經(jīng)過微生物的降解以及各種化學(xué)反應(yīng)共同作用而釀造出的原釀醬油才稱得上是高品質(zhì)的香菇醬油。為了得到一種高品質(zhì)的香菇醬油，本試驗以豆粕、小麥、烘干粉碎的香菇為原料制備香菇醬油成曲，通過單因素試驗研究成曲潤水量、接種量、香菇添加量和制曲時間4個因素對香菇醬油成曲中性蛋白酶活性的影響，通過正交試驗優(yōu)化香菇醬油制曲工藝，以期為香菇醬油的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：米曲霉AS3.042，煙臺大學(xué)生物工程實驗室保藏。

試驗原料：豆粕、小麥粉(均由山東魯花生物科技有限公司提供)、香菇(購自煙臺大學(xué)市場)。

1.2 主要試驗儀器

DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；D-1自動控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；MQD-B3R全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；TDL-5-A低速臺式大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 主要試劑

酪氨酸、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、干酪素、鹽酸：均為分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；福林酚：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 成曲的制備

將豆粕用熱水潤濕至無硬心后，與小麥顆粒按1∶1(質(zhì)量比)的比例混合，加入烘干粉碎的香菇，0.1 MPa，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。接入香菇粉馴化后的米曲霉AS3.042，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，待曲料升溫結(jié)塊時進行翻曲。

1.4.2 樣品粗酶液的制備

取一定量的樣品，進行充分研磨，準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，加入pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，定容至100 mL,置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h，期間搖勻3次。浸提完畢后，以5 000 r/min離心20 min得到粗酶液。此過程中需要測定中性蛋白酶酶活和曲料的水分含量。

1.4.3 分析檢測

中性蛋白酶酶活的測定：參考SB/T 10317-1999 《蛋白酶活力測定法》；曲料水分含量的測定：參考GB 5009.3-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》。

1.4.4 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗

1.4.4.1 潤水量的確定

在30 ℃下，分別將成曲的潤水量設(shè)定為46%、50%、54%、58%、62%(質(zhì)量比)，香菇添加量為5%(質(zhì)量比)，接種量為0.8×106個/g，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.2 接種量的確定

確定潤水量后，以最佳潤水量進行潤水制曲。在30 ℃下，分別將成曲的接種量設(shè)定為0.4×106，0.6×106，0.8×106，1.0×106，1.2×106個/g，香菇添加量為5%(質(zhì)量比)，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.3 香菇添加量的確定

確定潤水量和接種量后，在30 ℃下，分別將成曲中香菇添加量設(shè)定為1%、3%、5%、7%、9%(質(zhì)量比)，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.4 成曲制曲時間的確定

以最佳潤水量、接種量和香菇添加量進行制曲，發(fā)酵溫度不變。分別在30，42，54，66，78 h取樣，測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.5 制曲工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，分別以潤水量(A)、接種量(B)、香菇添加量(C)、制曲時間(D)4個因素為自變量，以中性蛋白酶酶活為響應(yīng)值(Y)，根據(jù)正交試驗確定制曲工藝的最佳條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 制曲工藝優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of koji-making technology

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與繪圖處理，SPSS 26.0進行單因素方差分析，所有測定重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 制曲工藝單因素試驗

2.1.1 潤水量對成曲中性蛋白酶活性的影響

水分既是使原料充分溶解的重要保證，又是維持米曲霉正常生長和代謝的必要條件。當(dāng)曲料中含水量適當(dāng)時，曲料吸水膨脹，營養(yǎng)物質(zhì)溶出，為米曲霉的生長提供養(yǎng)料，從而加速米曲霉的生長。因此，在制曲過程中應(yīng)該使曲料的水分活度保持在0.9左右，曲室相對濕度保持在90%左右，這樣才能保證米曲霉的最佳生長環(huán)境[13]。但潤水量也不宜過高，否則會造成曲料結(jié)塊、曲溫升高，反而容易增加染菌的風(fēng)險，會形成酸曲、花曲，造成曲的質(zhì)量下降[14]。成曲潤水量對醬油成曲中性蛋白酶活性的影響見圖1。

圖1 成曲中潤水量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of moistening water amount in finished koji on the activity of neutral protease

由圖1可知，潤水量在54%時，成曲的中性蛋白酶活性最高，為1 423.62 U/g干曲，當(dāng)潤水量高于54%時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。在制曲過程中，充足的水分使原料經(jīng)高溫蒸煮變性糊化，從而更有利于米曲霉對原料的充分利用，同時為米曲霉的生長和維持代謝提供了充足的水分。潤水量過低，無法提供米曲霉生長所需要的水分，導(dǎo)致米曲霉生長速度緩慢。而當(dāng)潤水量過高時，酶活降低，也驗證了上述的觀點，曲料容易結(jié)塊，部分曲溫變高，有利于其他雜菌的生長，使原料被雜菌利用降解，產(chǎn)生了難聞的氣味，從而影響了米曲霉的生長[15]。

2.1.2 米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉孢子從發(fā)芽生長至成熟期產(chǎn)酶能力不斷增強，但米曲霉的生長形態(tài)不是統(tǒng)一的，只有充足的接種量才能保證在一定的發(fā)酵時間內(nèi)有大量的米曲霉達到成熟期，進而使成曲酶活達到最高值[16]。接種量對醬油成曲中性蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 成曲中接種量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of inoculation amount in finished koji on the activity of neutral protease

由圖2可知，當(dāng)米曲霉接種量為0.6×106個/g時，成曲的中性蛋白酶活性最高，達到2 655.52 U/g干曲，當(dāng)高于此接種量時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。米曲霉接種量過低時酶活不高,這是因為雖然米曲霉生長達到成熟期，但是米曲霉生物量低，所以產(chǎn)生的酶的總量低；米曲霉接種量過高，成曲酶活降低，這可能是由于米曲霉菌絲大量繁殖，但是測定時大多數(shù)菌絲還沒有達到成熟期，所以產(chǎn)生的蛋白酶減少。但也有可能是因為接種量過高，米曲霉生長耗氧量急劇增加，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的氧氣量不足，而米曲霉是好氧微生物，因此對米曲霉的生長產(chǎn)生了影響，最終導(dǎo)致米曲霉產(chǎn)酶能力不強[17]。

2.1.3 香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉的生長主要靠豆粕和小麥提供氮源和碳源，而香菇的營養(yǎng)價值極其豐富，也可以為米曲霉的生長提供營養(yǎng)條件。但據(jù)報道，通過水和有機溶劑提取獲得的香菇提取物能夠抑制微生物的生長，因此香菇的添加量不宜過高，否則會對米曲霉的生長起到抑制作用[18]。香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 成曲中香菇添加量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of addition amount of Lentinus edodes in finished koji on the activity of neutral protease

由圖3可知，添加1%～5%(質(zhì)量比)的香菇，成曲的中性蛋白酶活性逐漸升高，香菇添加量為5%(質(zhì)量比)時，成曲的中性蛋白酶活性最高，達到3 348.30 U/g干曲，但香菇添加量高于5%(質(zhì)量比)時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。香菇中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)，添加適量的香菇可以為米曲霉的生長提供充分的能量，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性；但當(dāng)香菇添加量過高時，香菇中的一些抗菌類物質(zhì)比如多酚、黃酮類物質(zhì)[19]，可能會抑制米曲霉的生長，從而影響酶系的分泌，最終導(dǎo)致成曲的中性蛋白酶活性不高。

2.1.4 制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉從孢子發(fā)芽生長到成熟期需要一定的時間，這樣才能夠保證米曲霉達到最發(fā)達的酶系。但在實際生產(chǎn)過程中，從經(jīng)濟成本角度出發(fā)，制曲時間不宜過長，并且米曲霉生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的堆積也會對成曲酶活造成一定的影響[20]。制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4 制曲時間對中性蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of koji-making time on the activuty of neutral protease

由圖4可知，當(dāng)制曲時間在36～66 h時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸升高，當(dāng)制曲時間為66 h時，成曲中性蛋白酶活性最高，達到3 170.20 U/g干曲，當(dāng)制曲時間超過66 h時，中性蛋白酶活性急劇降低。66 h之前，米曲霉不斷生長繁殖，代謝分泌旺盛，因此中性蛋白酶活性不斷提高；制曲66 h時，米曲霉的生長達到成熟期，成曲的蛋白酶活性達到最大值；但當(dāng)制曲時間超過66 h時，米曲霉生長代謝產(chǎn)物的堆積可能對成曲酶活造成一定的影響。據(jù)報道，米曲霉在生長過程中糖代謝鏈會產(chǎn)生曲酸，并且隨著發(fā)酵的進行，曲酸產(chǎn)量會逐漸增加，而曲酸是良好的酪氨酸酶抑制劑，僅20 μg/mL 就可以抑制80%的酪氨酸酶活力[21-22]。因此如果制曲時間過長，米曲霉的代謝產(chǎn)物曲酸可能會對成曲的酶活產(chǎn)生抑制作用。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以潤水量(A)、米曲霉接種量(B)、香菇添加量(C)、制曲時間(D)為自變量，以中性蛋白酶活性為響應(yīng)值，進行正交試驗優(yōu)化制曲工藝，結(jié)果見表2。各因素對中性蛋白酶酶活的方差分析結(jié)果見表3。

表2 制曲優(yōu)化工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test for optimization of koji-making technology

續(xù) 表

表3 各因素對中性蛋白酶酶活的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of various factors on the activity of neutral protease

由表2可知，4個因素對酶活性的影響依次為B>C>D>A，最優(yōu)組合為A2B3C1D1，即當(dāng)成曲潤水量為54%(質(zhì)量比)，米曲霉接種量為0.8×106個/g，香菇添加量為3%(質(zhì)量比)，制曲時間為54 h時，成曲中性蛋白酶活性最高。由表3可知，米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活性的影響極其顯著，香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響較為顯著，而成曲潤水量和制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響不顯著。

2.3 結(jié)果驗證

以最優(yōu)組合進行發(fā)酵，即成曲潤水量為54%(質(zhì)量比)、米曲霉接種量為0.8×106個/g，香菇添加量為3%(質(zhì)量比)，制曲時間為54 h，發(fā)酵后測定成曲中性蛋白酶活性為4 414.31 U/g干曲，均高于正交試驗組合中的中性蛋白酶活性。

3 小結(jié)

將香菇與普通成曲混合來優(yōu)化制曲工藝，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性，這是原料中的蛋白質(zhì)被充分降解、提高香菇醬油氨態(tài)氮含量的前提。對成曲中性蛋白酶活性影響的因素從大到小依次為米曲霉接種量>香菇添加量>制曲時間>潤水量。香菇醬油制曲工藝最佳條件為米曲霉接種量0.8×106個/g、香菇添加量3%(質(zhì)量比)、制曲時間54 h、成曲潤水量54%(質(zhì)量比)。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵的香菇醬油成曲的中性蛋白酶酶活可達4 414.31 U/g干曲。