蒸汽預處理對黑蒜品質的影響

賈慶超，宋志強

(鄭州科技學院食品科學與工程學院 鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，鄭州 450064)

大蒜是蔥科蔥屬植物中一種十分有效的功能性食品原料[1]，性溫味辛，常被人們譽為“天然的抗生素”，醫學研究表明[2]，大蒜在心血管疾病、感染性疾病、腫瘤及糖尿病等的預防與治療方面具有活性作用。然而，其辛辣的味道和特有的氣味讓很多人望而生卻，尤其是未加工的生大蒜。黑蒜又稱為發酵黑蒜，是在不添加任何添加劑的情況下，通過控制溫度對整個大蒜進行數天發酵生產而成[3-4]，大蒜顏色在發酵過程中逐漸從白色或黃色變為深棕色[5]，主要發生非酶褐變、酚類氧化和多糖解聚等化學反應[6-7]，發酵過程的熱量加速了高分子量多糖降解為低分子量低聚糖和單糖，從而轉化為水溶性生物活性化合物，如S-烯丙基半胱氨酸、生物堿、多酚和類黃酮化合物，這些化合物與黑蒜的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗過敏和降血脂等保健功能有關，黑蒜的這些具有保健功能的物質取決于其加工的工藝條件[8]。研究表明[9]，預處理工藝可以改變黑蒜保健功能的活性物質。一般來說，高溫會破壞大蒜基質中的細胞結構，促使黑蒜在發酵過程中物質的釋放進而相互反應。蒸汽處理是水果和蔬菜加工中使用的一種常見的熱處理方法，它通過果膠多糖的解聚導致細胞膜損壞[10-11]，就加工時間和黑蒜的特性而言，蒸汽預處理工藝可能是提高黑蒜產品加工效率的一種簡單替代技術。本研究的目的是研究蒸汽預處理工藝對黑蒜品質的影響，主要研究了不同蒸汽預處理時間制備的黑蒜的一些性能指標和抗氧化活性，為黑蒜的發展研究提供了有力的數據參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市購；EDTA-2Na、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、焦性沒食子酸、沒食子酸、無水乙醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、雙氧水、鄰苯三酚：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鈉：鄭州派尼化學試劑廠；苯酚、巴比妥酸：上海展云化工有限公司；濃硫酸、濃鹽酸：洛陽昊華化學試劑有限公司；蔗糖：天津市恒興化學試劑制造有限公司；鐵氰化鉀、濃鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、亞硝酸鈉：鄭州市德眾化學試劑廠；Tris、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、茚三酮、福林酚(1 mol/L)：福州飛凈生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1004 Bsartorius電子天平 賽多利斯公司；PXSJ-216離子分析儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫發酵箱 上海科恒實業發展有限公司；Anke TDL-50B離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水溫箱、電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；KQ5200B機械型超聲波清洗儀 上海合金超聲設備有限公司；UV-4802H紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；CR-400 型色差儀 日本Minolta公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大蒜的蒸汽預處理

首先選取新鮮大蒜去皮、去根蒂清洗，將蒸汽鍋內水燒開5 min，使汽蒸鍋內的蒸汽達到飽和，將清洗過的大蒜瓣迅速放在蒸鍋的篦子上，進行蒸汽預處理。預處理時間分別為3，5 min(以下分別簡寫為PT3、PT5)，將處理好的蒜瓣于室溫下，通風櫥中干燥1 h，同時和未進行任何處理的大蒜(以下簡寫為PN)，一起用于制備黑蒜。

1.3.2 黑蒜的制備

根據趙雪晴等[12]和Zhang等的研究，將預處理好的大蒜PT3、PT5和未進行預處理的大蒜PN放入發酵箱內，保持濕度不變，設定發酵溫度為70 ℃，進行發酵，每隔2 d定量取出發酵的黑蒜進行指標測定，發酵的總時間為18 d。

1.3.3 褐變程度的測定

根據Li等[13]的方法，使用色差計測量色度。在色差計中，樣品的顏色由3個維度L*、a*和b*表示。L*值(反射率)衡量產品對光的反射，范圍從完美白色的 100 到黑色的 0。紅色/綠色和黃色/藍色分別用a*和b*值表示。色差計在測量前使用白色和黑色標準進行校準。褐變程度以ΔE表示：

ΔE=[(L*-L0)2+(a*-a0)2+(b*-b0)2]1/2。

式中：L*、a*、b*分別為色差計的測定值；L0、a0、b0分別為未進行任何處理的大蒜的測定值。

1.3.4 水分含量的測定

采用GB 5009.3—2016中的第一法直接干燥法對水分含量進行測定，干燥溫度為60～65 ℃。

1.3.5 氨基酸-N含量的測定

采用電位滴定法進行氨基酸-N含量的測定。

1.3.6 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法[14-15]測定總酚含量。在760 nm下測定吸光度，沒食子酸標準曲線為Y=94.893X+0.009 6，R2=0.999 6。

1.3.7 還原糖含量的測定

采用DNS法[16](3,5-二硝基水楊酸顯色法)測定還原糖含量，在494 nm處測定吸光度，葡萄糖標準曲線為Y=0.006 2X—0.002 1，R2=0.999 5。

1.3.8 5-HMF(5-羥甲基糠醛)含量的測定

采用李良等[17]和Li等的方法進行測定。

1.3.9 總黃酮含量的測定

參考鄭清等[18]、趙曉娟等[19]的方法，配制0.2 mg/mL的蘆丁溶液，分別取0，1，2，3，4，5 mL，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理，在510 nm處測定吸光度，繪制標準曲線為：Y=1.986 3X—0.002 8，R2=0.999 2。黃酮含量計算公式為：

式中：X為黃酮含量(mg/g)；C為根據標準曲線求得的質量濃度(mg/mL)；V為所取液體的體積(mL)；A為所取待測液的稀釋倍數；B為黑蒜粉末質量(g)。

1.3.10 總酸含量的測定

參考加雪梅[20]的方法進行總酸含量的測定。

1.3.11 DPPH·、·OH清除率的測定

參考趙曉娟等的DPPH·、·OH清除活性測定方法，進行抗氧化性的測定。

1.3.12 發酵終點的判斷

結合黑蒜的企業標準Q/LYY 0001S-2010、Q/SJC 0001S-2010、Q/STY 0001S-2013、Q/SHD 0001S-2011等，參考趙雪晴等的研究結果，黑蒜的發酵標準制定為：水分含量(g/100 g)≤40，還原糖含量(g/100 g)≥25，總酚含量(mg/g)≥8，5-HMF(mg/g)≤13.0，氨基酸-N含量(g/100 g)≥5.0。

2 結果與分析

2.1 黑蒜的褐變程度

圖1 褐變程度Fig.1 Browning degree

ΔE的大小意味著黑蒜顏色的深淺，ΔE值越大，大蒜的褐變程度越大，黑蒜的顏色越深[21]。由圖1可知，PT3和PT5的ΔE在發酵18 d內均比未處理的大蒜的ΔE要大，說明蒸汽處理可以促進美拉德反應的發生，促進黑蒜更快發酵。PT3和PT5的ΔE分別在發酵第10天和第12天基本趨于穩定，說明這時候黑蒜基本發酵形成。另外，PT3和PT5的褐變程度均大于PN，Nugrahedi和Li等指出，蒸前處理可能通過破壞細胞壁和細胞結構來誘發黑蒜的發黑，大蒜中還原糖、氨基酸-N含量、酚類化合物等成分更加容易釋放出來，促進美拉德褐變反應的發生。PT3的ΔE大于PT5，Fante等[22]指出可能是由于PT5促使多酚氧化酶(PPO)失活，從而不利于美拉德反應的發生，而PT3則不足以使大蒜PPO活性完全失活，以上說明3 min的蒸汽預處理時間比較適宜。

2.2 水分含量

由圖2可知，3種條件下的大蒜在發酵過程中水分含量均呈現下降的趨勢，尤其是PT3水分含量下降得更加明顯一些，說明PT3美拉德反應更加強烈。根據1.3.12中黑蒜指標的要求，在發酵第18天時，由未處理大蒜發酵制備的黑蒜的水分含量才符合黑蒜的指標要求，PT3和PT5在第6天、第10天就已經符合要求，說明蒸汽預處理可以大大縮短黑蒜發酵所需的時間，節約時間成本，且在第18天時，水分含量PT3

圖2 水分含量Fig.2 Moisture content

2.3 還原糖含量

在黑蒜加工過程中，黑蒜中的還原糖含量取決于兩個因素：一是大蒜中的多糖被降解為還原糖，二是還原糖在美拉德反應過程中被消耗，黑蒜中還原糖含量的變化是二者共同作用的結果。由圖3可知，在黑蒜的發酵前期，PT3、PT5和PN均呈現上升的趨勢，是由于多糖的降解生成還原糖的速率大于美拉德反應消耗還原糖的速率，而后期還原糖含量下降則是美拉德反應的速率大于多糖的降解速率所致。在黑蒜發酵18 d內，PT3、PT5的還原糖含量均比PN的還原糖含量高一些，尤其是對于PT3、PT5，還原糖含量分別在第12天和第10天達到最大值，分別為60.18 g/100 g和61.36 g/100 g，而此時PN的還原糖含量為47.11 g/100 g和48.29 g/100 g，均增大了25%左右，說明蒸汽預處理可以破壞大蒜的細胞壁和細胞結構，促使還原糖更好地釋放出來。

圖3 還原糖含量Fig.3 Reducing sugar content

2.4 5-HMF含量

5-HMF 主要通過美拉德反應和糖類脫水形成[23]，是美拉德反應的中間產物，味道略苦，它的積累與黑蒜的甜味有關。由圖4可知，在發酵過程中，5-HMF的含量逐漸增加，且PN>PT5>PT3，說明蒸汽預處理可以降低5-HMF的含量，增加所加工的黑蒜的甜度。王聰聰等[24]指出，pH值是影響5-HMF的重要因素，在黑蒜的加工過程中，酸性條件有利于5-HMF的生成，堿性條件則抑制5-HMF的生成。在黑蒜的加工過程中，PN的pH值較小，一定程度上加速了5-HMF的生成。另外，還原糖的含量也是影響5-HMF的重要條件，PT3和PT5分別在發酵第12天和第10天還原糖含量出現最大值，5-HMF的含量隨后也出現較大程度的增長。

圖4 5-HMF含量

2.5 氨基酸-N含量

氨基酸是美拉德反應的重要底物，其含量直接影響黑蒜的品質，主要取決于兩個因素：一是美拉德反應的消耗，二是大蒜在加工過程中蛋白質的分解。由圖5可知，隨著黑蒜加工時間的增加，蛋白質的生成量大于美拉德反應的消耗量[25]，且大蒜發酵過程中水分減少，均促使氨基酸-N含量上升。后來由于美拉德反應的消耗量大于蛋白質的分解生成量，使其呈現減小的趨勢。另外，氨基酸也可與 5-HMF 發生美拉德反應[26-27]，從而減少5-HMF 的積累，增加黑蒜的風味。從發酵的第10天開始，氨基酸-N含量均小于PN，大蒜加工結束后，蒸汽預處理的大蒜氨基酸-N含量比PN分別降低了27.56%和20.10%。美拉德反應在黑蒜加工中很重要，褐變程度反映了美拉德反應的速度。在同一加工時間下蒸汽預處理大蒜的褐變程度明顯大于PN，因此蒸汽預處理大蒜對氨基酸-N的消耗量高于PN。

圖5 氨基酸-N含量Fig.5 Amino acid-N content

2.6 總黃酮和總酚含量

黃酮類和酚類化合物結構復雜，廣泛存在于自然界動物和植物體中，是理想的天然抗氧化劑[28]。由圖6可知，隨著發酵時間的增加，PT3、PT5和PN總黃酮和總酚含量均呈現增加的趨勢，在發酵第10天時，PT3的總黃酮和總酚含量超過PN，在發酵第18天時，總黃酮和總酚含量PT3>PN>PT5，PT3的總黃酮和總酚含量相對PN分別提升了84.2%和58.7%，說明PT3有利于提升發酵黑蒜的黃酮和酚類化合物的含量，增強發酵黑蒜的抗氧化性，而PT5不利于提升二者的含量。據報道，大蒜中的生物活性物質在發酵過程中增加，尤其是多酚和類黃酮等抗氧化活性物質，這可能是由于高分子量多酚類化合物的分解，釋放出新的低分子量衍生物。同時大蒜熱處理可導致蒜氨酸酶失活，進而阻斷γ-谷氨酰基半胱氨酸水解和氧化成細胞毒性化合物，可能有利于γ-谷氨酰基半胱氨酸在黑蒜發酵過程中轉化為黃酮和酚類等功能性化合物[29]。此外，蒸汽預處理可通過破壞大蒜基質中的細胞膜而誘導一些化合物的釋放，從而提高美拉德反應速率，促使黑蒜在發酵過程中生成更多的功能活性化合物[30]。

圖6 總黃酮和總酚含量Fig.6 Total flavonoid and total phenol content

2.7 總酸含量

美拉德反應是一個產酸的過程，其中間產物α-二羰基化合物能夠通過降解生成甲酸、乙酸等有機酸[31]。由圖7可知，隨著發酵時間的延長，PT3、PT5和PN總酸含量均增加，在發酵第18天時均達到最大值，且總酸含量PT3>PT5>PN，說明大蒜的蒸汽預處理可以增加黑蒜的總酸含量，其酸度增加與發酵過程中形成的褐變物質有關，此時其總酸含量均小于40 mg/g，可產生令人愉快的酸味，張曉溪等[32]關于美拉德反應研究的結果亦表明，pH值均隨著美拉德反應的進行而降低，反應體系的酸度逐漸增加。綜上所述，在發酵第18天時，制備的黑蒜完全符合要求，蒸汽預處理可大大縮短黑蒜的制備時間。

圖7 總酸含量Fig.7 Total acid content

2.8 抗氧化性

DPPH·溶于乙醇，在517 nm波長處有最大吸光度，是一種穩定的自由基。當DPPH·遇到抗氧化性物質時，接受被測樣品提供的電子或氫后，形成穩定的分子，溶液顏色減退，導致其吸光度減小。根據吸光度的大小可以判斷被測樣品抗氧化能力的強弱[33]。

圖8 DPPH·的清除能力Fig.8 Scavenging ability of DPPH· free radicals

由圖8可知，隨著黑蒜發酵時間的增加，其抗氧化性逐漸增大，最大時PT3、PT5和PN三者分別達到76.3%、73.8%和55.8%，尤其是發酵8 d以后，DPPH·清除率增加的幅度更大，這與其總酚和總黃酮的變化趨勢是一致的。另外，PT3的DPPH·清除率稍大于PT5，且二者均比PN大，尤其是8 d以后，PT3和PT5比PN更大一些，最大時分別相對PN增加36.3%和32.2%。以上說明PT3更有利于提升黑蒜對DPPH·的清除率，同時也說明蒸汽預處理可以提升黑蒜對DPPH·的清除率。

圖9 ·OH的清除能力Fig.9 Scavenging ability of ·OH free radicals

·OH具有較強的得電子能力，會誘導DNA 鏈斷裂和堿基改性，從而引起如癌癥等一系列疾病，其產生的Fenton反應為：Fe2++H2O2→Fe3++·OH +OH-。抗氧化性的物質可以直接清除羥自由基，減少羥自由基的產生量，吸光度值降低[34]。

由圖9可知，隨著發酵時間的增加，PT3、PT5和PN對·OH的清除率均逐漸增大，且PT3>PT5>PN，PT3、PT5與PN之間的差距隨著發酵時間的增加逐漸增大，PT3和PT5最大時分別達到53.7%和50.6%，相對PN分別增大了44.7%和36.3%。以上說明PT3更有利于提升黑蒜對·OH的清除率，同時也說明蒸汽預處理可以提升黑蒜對·OH的清除率。

Bae和Lu等指出，在一定發酵溫度下，黑蒜的顏色深淺取決于其發生的美拉德、酚類氧化和多糖降解等復雜反應，這些復雜反應提供了各種各樣的生物活性化合物，如美拉德反應中間物、多酚和黃酮類等化合物，這些物質對于提升黑蒜的抗氧化性是非常有利的，而其質量和數量取決于所使用的生產工藝[35-36]。綜上所述，蒸汽預處理可提高黑蒜的抗氧化活性，且PT3優于PT5。為了進一步探索蒸汽預處理制備黑蒜的最佳工藝，下一步的工作重點是將蒸汽預處理的時間設置更加細致一些，比如預處理50 s、1 min、2 min等，結果值得期待。

3 結論

相對PN而言，蒸汽預處理使黑蒜的褐變程度ΔE在更短時間內趨于穩定，還原糖更加容易生成，根據黑蒜的標準，PT3形成黑蒜的時間為第10天，PT5形成黑蒜的時間為第12天，而PN形成黑蒜的時間為第18天，說明PT3是比較好的蒸汽預處理時間，此時5-HMF含量較低，總黃酮、總酚等抗氧化性物質含量較高，黑蒜具有較強的抗氧化活性，而且在更短的時間內制備出黑蒜，節約了時間成本，具有更廣闊的發展空間。所以進一步研究蒸汽預處理的價值很高，同時也可以結合目前部分研究者提出的冷凍預處理，將二者預處理工藝聯合也將是下一步研究的重點。