微波提取香菇多糖制備微膠囊的抑菌抗氧化活性研究

何皎，孫曉菲，潘琳，田慧敏,陳霞

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南科技大學微生物資源開發與利用校級重點實驗室，食品微生物河南省工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

香菇在世界食用菌中排行第二，在食用和藥用方面都具有較高的價值，香菇多糖為香菇提取物中最重要的活性成分之一[1-2]。在調控機體免疫、抗菌和抗病毒、抗寄生蟲、神經系統保護和抗氧化等方面的作用顯著[3]。微波輔助法為目前獲取香菇多糖的較優方法[4-5]。目前，納米級微膠囊的制備技術已經逐漸滲透到醫藥、食品、生物等領域中。微膠囊可以很好地隔絕藥物與外界的接觸，達到保護藥物、減緩其變性的目的[6-7]，并且外層的壁材能夠起到控制藥物釋放的目的，使藥物的釋放速度能夠人為控制[8]，從而提高藥物的療效與作用。本實驗采用β-環糊精作為壁材，香菇多糖作為芯材制備微膠囊，旨在最大限度地發揮香菇多糖的生物活性[9-10]。

本研究以微波輔助提取制備香菇多糖β-環糊精微膠囊，以期為開發新型香菇多糖防腐劑及抗衰老保健品提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 材料

實驗所用的干香菇購自洛陽白云山五馬寺村；β-環糊精購自綠葉生物科技有限公司。

1.2 菌種

沙門氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等菌種為本實驗室保藏。

2 實驗方法

2.1 供試品的制備

將干香菇粉碎，過40目篩，置于棕色瓶中備用。

2.2 微波提取香菇多糖的提取工藝流程[11-13]

準確稱取5份過40目篩后的香菇粉各1 g分別于500 mL燒杯中，按預設料液比各加入適量蒸餾水攪拌均勻，在預設微波功率的條件下處理相應時間。處理好的樣品得濾液，量出其體積并倒入燒杯中，按其體積的3倍加入無水乙醇，4 ℃醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，取沉淀于不同的燒杯中，加蒸餾水在100 mL容量瓶中進行定容，得到含香菇多糖的溶液后分裝進行冷凍干燥。

2.3 抑菌與抗氧化雙活性檢測[14-16]

2.3.1 培養基制備與菌種活化

BPA培養基、LB培養基配方均參考現代分子生物學實驗技術第二版。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌用各自培養基復蘇備用。

2.3.2 抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定抑菌活性，在帶孔混菌平板中按順序加入 100 μL樣品，以100 μL無菌水作為陰性對照，100 μL相應濃度的尼泊金甲脂醇溶液作為陽性對照，每組設 3個平行，平板于相應溫度恒溫培養 12～24 h，電子游標卡尺測量抑菌圈直徑，記錄數據。

2.3.3 抗氧化測定

2.3.3.1 DPPH·清除能力測定

吸取2.0 mL待測液，加入0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液4.0 mL，25 ℃避光反應30 min，以無菌水調零，在517 nm波長處測定吸光度值A1，用無菌水代替DPPH所測值為吸光度值A2，用無菌水代替待測液所測值為吸光度值A0，同時以同濃度的維生素C溶液作為陽性對照，重復3次。

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2.3.3.2 羥自由基清除能力測定

試管中依次加入樣品溶液2 mL、9 mol/L H2O2溶液2 mL，室溫靜置10 min，再加入9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL，混勻室溫靜置 40 min，于510 nm 處測吸光度A1；用相同濃度乙醇替代水楊酸-乙醇溶液，其余條件不變測得A2；同濃度乙醇替代樣品溶液，其余條件不變測得吸光度值A0。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2.4 微波提取香菇多糖的提取工藝單因素實驗

2.4.1 微波功率對香菇多糖得率的影響

提取工藝流程依據2.2，固定料液比為1∶30，微波時間為2 min，分別在微波功率為0，119，238，385，539 W的條件下進行處理，結果見圖1。

圖1 微波功率對香菇多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of lentinan

由圖1可知，當微波功率為119 W時，香菇多糖得率達到最高，為7.95%，故選擇微波功率為119 W進行優化。

2.4.2 微波時間對香菇多糖得率的影響

在料液比1∶40、微波功率119 W的條件下處理2，4，6，8，10 min，其余實驗操作條件同2.4.1。

圖2 微波時間對香菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the yield of lentinan

由圖2可知，當微波時間為4 min時，香菇多糖得率達到最高，時間超過4 min時，香菇多糖得率逐漸下降，故選擇微波提取時間4 min進行優化最適宜。

2.4.3 料液比對香菇多糖得率的影響

固定微波功率119 W，處理2 min，料液比分別為為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，其余實驗操作條件同2.4.1。

圖3 料液比對香菇多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of lentinan

由圖3可知，料液比為1∶40時，香菇多糖得率達到最大，故選擇料液比1∶40進行優化最適宜。

2.5 響應面法優化香菇多糖提取工藝實驗

結合單因素實驗得到的結果，確定料液比為1∶30、1∶40、1∶50；微波功率為0，119，238 W；微波時間為2，4，6 min。利用響應面法中的Box-Behnken設計三因素三水平實驗，測定樣品在490 nm處的吸光度，得出香菇多糖得率，結果見表1。

表1 響應面實驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析所得數據并擬合多元回歸方程：Y=9.59-1.15A-1.08B+0.016C-1.00AB+0.23AC-0.22BC-1.61A2-0.85B2-1.73C2。由方程一次項系數可知，影響香菇多糖得率最大的因素是料液比，其次是微波功率和微波時間。

2.5.1β-環糊精香菇多糖微膠囊的制備工藝單因素實驗

稱取適量β-環糊精4份，溶解于25 mL蒸餾水中，50 ℃恒溫攪拌保持20 min后，分別加入預設香菇多糖。分別加入不同量乳化劑吐溫80，置于磁力攪拌器中，設置溫度為50 ℃，保持恒定轉速攪拌30 min，得乳狀液。將所得不同乳化劑添加量的乳狀液分別倒入單個培養皿內，放入冷凍干燥機，進行冷凍干燥。將凍干后所得到的固體物質研磨成細粉狀，裝瓶備用，即得香菇多糖β-環糊精微膠囊。

2.5.2 不同乳化劑添加量的香菇多糖β-環糊精微膠囊的制備

固定包埋時間為30 min，固形物質量濃度為20 g/dL，壁材和芯材比例為1∶3，乳化劑添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，以枯草芽孢桿菌為指示菌，抑菌圈直徑作為指標，結果見圖4。

圖4 乳化劑添加量對微膠囊抑菌活性的影響Fig.4 Effect of the addition amount of emulsifier on the antibacterial activity of microcapsules

由圖4可知，當乳化劑添加量為0.3%時，微膠囊的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為16.7 mm。

2.5.3 不同固形物質量濃度的香菇多糖β-環糊精微膠囊的制備

固定乳化劑添加量為0.2%，包埋時間為30 min，壁材和芯材比例為1∶3，分別在固形物質量濃度為10，20，30，40 g/dL的條件下制備香菇多糖β-環糊精微膠囊，其余步驟同2.5.1。

圖5 固形物質量濃度對微膠囊抑菌活性的影響Fig.5 Effect of mass concentration of solids on the antibacterial activity of microcapsules

由圖5可知，香菇多糖β-環糊精微膠囊的抑菌活性在固形物質量濃度為20 g/dL時達到最大值，其抑菌圈直徑為16.4 mm。

2.5.4 不同包埋時間的香菇多糖β-環糊精微膠囊的制備

固定乳化劑添加量為0.2%，固形物質量濃度為20 g/dL，壁材和芯材比例為1∶3，分別在包埋時間為20，30，40，50 min的條件下制備香菇多糖β-環糊精微膠囊，其余步驟同2.5.1。

圖6 包埋時間對微膠囊抑菌活性的影響Fig.6 Effect of embedding time on the antibacterial activity of microcapsules

由圖6可知，隨著包埋時間的增加，香菇多糖β-環糊精微膠囊的抑菌活性不斷增大，在包埋時間為40 min時，抑菌圈直徑達到最大值17.9 mm。

2.6 響應面法優化香菇多糖β-環糊精微膠囊工藝實驗

結合單因素實驗確定乳化劑添加量的梯度范圍為0.2%、0.3%、0.4%；包理時間的梯度范圍為30，40，50 min；固形物質量濃度為10，20，30，40 g/dL。利用響應面軟件中的 Box-Behnken 功能設計三因素三水平實驗，以枯草芽孢桿菌為指示菌，使用抑菌圈直徑作為響應值。

得到回歸方程：Y=17.04-0.21D-0.18E-0.12F+0.010DE+0.013DF+0.033EF-0.50D2-0.92E2-1.09F2。

2.6.1 回歸模型的方差分析

對回歸方程方程進行分析，結果見表2。

表2 回歸模型方差分析結果Table 2 The variance analysis results of regression model

2.6.2 優化提取參數及驗證

通過軟件中的 Optimization 程序優化得到：乳化劑添加量0.38%、包埋時間39 min、固形物質量濃度19.5 g/dL。根據實際情況調整最佳工藝參數為乳化劑添加量0.38%、包埋時間39 min、固形物質量濃度20 g/dL，抑菌圈直徑理論值為16.59 mm。通過3次驗證實驗，得到抑菌圈大小為17.07 mm，與預測值非常接近，說明按照模型進行實驗準確可行。由表2可知，擬合方程的相關系數RAdj2=0.975 4，說明該模型能夠解釋97.54%的響應值的變化。相關系數R2=0.989 3>0.9，說明該模型擬合程度好，實驗誤差小，可以用此模型對制備工藝參數進行分析以及預測。該模型中D、E、F、D2、E2、F2項達到顯著水平。影響香菇多糖β-環糊精微膠囊的抑菌活性的最顯著因素為乳化劑添加量。

圖7 固型物質量濃度、乳化劑添加量、包埋時間的交互作用對抑菌圈直徑影響的響應面及等高線Fig.7 The response surface diagrams and contour lines of effect of interaction of mass concentration of solids, emulsifier addition amount and embedding time on the antibacterial zone diameter

3 結論與討論

3.1 香菇多糖β-環糊精微膠囊的掃描電鏡觀察

通過單因素實驗結合響應面優化得到最佳工藝制備的香菇多糖納米膠囊的掃描電鏡圖。采用掃描電子顯微鏡測得最佳條件下納米微粒粒徑的形態,見圖8。

圖8 香菇多糖納米微膠囊的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrograph of lentinan nanocapsules

3.2 香菇多糖β-環糊精微膠囊的抑菌抗氧化效果

香菇多糖β-環糊精微膠囊及相應成分抑菌性對比見表3，香菇多糖β-環糊精微膠囊及相應成分抗氧化對比見表4。

表3 香菇多糖β-環糊精微膠囊及相應成分抑菌性對比Table 3 Antibiosis comparison of lentinan β-cyclodextrin microcapsules and the corresponding components mm

表4 香菇多糖β-環糊精微膠囊及相應成分抗氧化對比Table 4 Antioxidant comparison of lentinan β-cyclodextrin microcapsules and the corresponding components %

結果表明，微波提取香菇多糖的最佳工藝條件為料液比1∶40、微波提取時間4 min、微波功率119 W。香菇多糖β-環糊精微膠囊的最佳制備工藝為乳化劑添加量0.38%、包埋時間39 min、固形物質量濃度19.5 g/dL。得出納米級微膠囊對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較強，對沙門氏菌的抑制作用較弱，同時具有較好的抗氧化性。所制備的微膠囊抑菌活性和抗氧化活性與香菇多糖相比有增幅。通過微波獲得的香菇多糖制作的微膠囊可作為藥物和功能性食品工業中天然防腐劑與抗氧化劑組分，作為新型天然抗菌抗氧化劑使用具有巨大潛力。因此，未來應對其結構和功能評估進一步研究。