海洋產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株Stenotrophomonas nitritireducens CZW003的篩選、鑒定及酶學(xué)特性研究

趙倩，丁志雯，錢(qián)亮亮，李甜，黃志發(fā)，房耀維，劉姝*

(1.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市質(zhì)量技術(shù)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222005)

幾丁質(zhì)(chitin)又名甲殼素，由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)殘基的線性鏈組成，并由氫鍵緊密連接，是廣泛存在于自然界中的一種含氮多糖類(lèi)生物性高分子，在海洋中尤為豐富，是海洋生物N和C的能量來(lái)源[1]。部分海產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中含有大量的甲殼素，因其難溶于水及普通溶劑，常被當(dāng)作廢物丟棄，導(dǎo)致環(huán)境污染[2—4]。而幾丁質(zhì)的水解產(chǎn)物幾丁寡糖廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)和食品等多個(gè)領(lǐng)域，具有抗真菌、殺蟲(chóng)、抗瘧疾、抗癌、降血脂和提高食品質(zhì)量等特性[5]。

目前，制備幾丁寡糖的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物酶法。幾丁質(zhì)酶催化制備幾丁寡糖的生物酶方法綠色、安全、高效[6—7]。不僅減少了環(huán)境污染，而且降低了工業(yè)成本。幾丁質(zhì)酶是一種專(zhuān)一催化幾丁質(zhì)生成幾丁寡糖的酶。細(xì)菌、真菌和病毒等微生物，以及植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶[8—9]。其中，由于微生物幾丁質(zhì)酶易于生產(chǎn)制備的優(yōu)勢(shì)，因而逐漸成為研究熱點(diǎn)。已報(bào)道有超70種微生物可分泌出幾丁質(zhì)酶，海洋微生物蘊(yùn)藏巨大潛力，如Clonostachysrosea[10]，Pseudoalteromonassp.DL-6[11]，Paenicibacillusbarengoltzii[12]，Moritellamarina等[13]來(lái)自海洋微生物，具有較強(qiáng)的分泌幾丁質(zhì)酶的能力。

工業(yè)上大多采用強(qiáng)酸進(jìn)行甲殼素的預(yù)處理以及后續(xù)的低溫發(fā)酵，因此如能挖掘出低溫耐酸的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，在工業(yè)化應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢(shì)。與環(huán)境來(lái)源的幾丁質(zhì)酶相比，從海洋微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶，易培養(yǎng)，pH和溫度范圍較廣[14]。但目前，海洋幾丁質(zhì)酶報(bào)道中多在偏堿性條件下具有最大活性及穩(wěn)定性，例如海洋細(xì)菌Bacillussp. R2產(chǎn)幾丁質(zhì)酶最適pH為7.5，在pH 7.0～8.0之間具備很好的穩(wěn)定性[15]；Pseudoalteromonassp. DC14產(chǎn)幾丁質(zhì)酶最適pH為9.0， 在pH 8.0～11.0之間保持較好的穩(wěn)定性等[16]；而在酸性環(huán)境下表現(xiàn)出最佳活性及穩(wěn)定性鮮少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從海泥中篩選并鑒定菌株CZW003為Stenotrophomonasnitritireducens(還原亞硝酸鹽寡養(yǎng)單胞菌)，目前關(guān)于海洋來(lái)源的S.nitritireducens產(chǎn)幾丁質(zhì)酶尚無(wú)報(bào)道，通過(guò)研究其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性，為低溫耐酸幾丁質(zhì)酶的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為制備幾丁寡糖提供了新穎酶源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

連云港市風(fēng)景區(qū)連島海域的海泥，置于便攜冷藏保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 海洋微生物培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：10 g粉狀幾丁質(zhì)、0.5 g MgSO4·7H2O、0.3 g KH2PO4、0.7 g K2HPO4、0.01 g ZnSO4、0.01 g FeSO4·7H2O、1 L陳海水，調(diào)配至pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：20 g瓊脂、10 g硫酸銨、10 g膠體幾丁質(zhì)、0.3 g KH2PO4、0.7 g K2HPO4、1.5 g MgSO4·7H2O、1 L陳海水，調(diào)配至pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、5 g酵母粉、1 L陳海水，調(diào)配至pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g粉狀幾丁質(zhì)、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、0.3 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1 L陳海水，調(diào)配至pH 7.0。

1.3 儀器設(shè)備

LRHS-250B智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HS-F16/3離心機(jī) 德國(guó)賽默飛世爾公司；E200生物顯微鏡 Nikon公司；T100 PCR儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選

用分析天平稱(chēng)取1 g海泥試樣于50 mL富集培養(yǎng)基中，設(shè)定溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min恒溫?fù)u床，培養(yǎng)48～120 h。取富集后的樣液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，并各取0.05 mL均勻涂布于兩個(gè)平板，倒置培養(yǎng)在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中4～6 d，每天觀察直至菌落出現(xiàn)透明圈，有透明圈的菌落即為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，挑選透明圈清晰且最大的菌落，用三區(qū)劃線方法進(jìn)行純化培養(yǎng)24～72 h，觀察直至出現(xiàn)單菌落。

1.4.2 菌株CZW003的鑒定

依照文獻(xiàn)[17]對(duì)純化培養(yǎng)的菌株CZW003進(jìn)行菌落、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色特征觀察，并對(duì)其生理生化特征進(jìn)行測(cè)定。提取菌株CZW003的總DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。PCR細(xì)菌通用引物：27F：5′-AGA-GTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCT-TGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Template DNA(1 μL)；上游引物27F(1 μL)；下游引物1492R(1 μL)；Premix(25 μL)；ddH2O(22 μL)。PCR反應(yīng)流程：94 ℃預(yù)變性5 min，不循環(huán)；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min，不循環(huán)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃冷藏保存。基因序列寄送南京思普金生物科技有限公司測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果上傳GenBank，用BLAST與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有核糖序列進(jìn)行種屬同源性比對(duì)，挑選同源性相近的菌株，用MEGA 7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.4.3 膠體幾丁質(zhì)的制備

參照陳茜文等[18]的方法制備膠體幾丁質(zhì)。稱(chēng)取20 g粉狀幾丁質(zhì)緩慢倒入200 mL濃HCl中，再加入200 mL蒸餾水，并用磁力攪拌器不斷攪拌12 h后，倒入2 L、4 ℃的95%乙醇中，混勻后放室溫靜置12 h，設(shè)置離心機(jī)4 ℃、5 000 r/min離心20 min，將沉淀物加蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，最終用蒸餾水定容至1 L，置于4 ℃保存，備用。

1.4.4 酶活的測(cè)定

參考常國(guó)煒等[19]的研究方法制備DNS試劑，并用DNS法測(cè)定還原糖含量[20]。稱(chēng)取100.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100.00 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將其稀釋成5個(gè)不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并且設(shè)空白對(duì)照，加入DNS試劑煮沸5 min顯色，測(cè)定540 nm處的吸光值并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。用移液槍取100 μL粗酶液與900 μL 1%的膠體幾丁質(zhì)，于35 ℃水浴30 min，再加入1.5 mL DNS試劑煮沸5 min顯色，離心取上清液，在540 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。酶活力單位(U)：在最適條件下，每分鐘生成1 μmol還原糖所消耗的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。相對(duì)酶活(%)：酶在各組不同條件下酶活性相對(duì)最高酶活性的百分比。

1.4.5 酶學(xué)特性研究

1.4.5.1 酶最適溫度及其穩(wěn)定性

設(shè)定5～65 ℃不同反應(yīng)溫度，分別測(cè)定不同溫度下的酶活力；將上述不同溫度條件下的酶保溫0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，再分別測(cè)定酶活力。將每組的最高酶活設(shè)為100%，其他各組為相對(duì)酶活，探究酶最適溫度及其穩(wěn)定性情況。每組設(shè)計(jì)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.5.2 酶最適pH及其穩(wěn)定性

調(diào)配pH值分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0不同梯度的磷酸鹽緩沖液后，加入粗酶液與底物，一并于30 ℃恒溫水浴鍋中保育，分別測(cè)定不同pH條件下的酶活力；將上述不同pH值的混合液在30 ℃恒溫水浴鍋中繼續(xù)放置12 h后，再分別測(cè)定其酶活力。將最高酶活的一組設(shè)為100%，其他各組為相對(duì)酶活，探究酶最適pH及其穩(wěn)定性情況。每組設(shè)計(jì)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.5.3 金屬陽(yáng)離子和EDTA對(duì)酶活的影響

以1%膠體幾丁質(zhì)為底物，向粗酶液中分別加入含Mg2+、Na+、Hg+、Co2+、Fe2+、Ca2+、Ag+、Zn2+、K+的金屬陽(yáng)離子溶液以及EDTA，濃度均為1 mmol/L，再分別測(cè)酶活。以只加入蒸餾水的酶液酶活為100%，其他各組為相對(duì)酶活，探究金屬陽(yáng)離子對(duì)酶活的影響。

1.4.5.4 底物特異性

分別選擇粉狀幾丁質(zhì)、殼聚糖、膠體幾丁質(zhì)作為底物，與粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，按照質(zhì)量體積比0.5%形成反應(yīng)體系，在其最適條件下測(cè)定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選

將富集培養(yǎng)基上的海泥樣品梯度稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基上，通過(guò)透明圈法挑取透明圈明顯且較大的菌株共4株，透明圈最大的命名為CZW003，見(jiàn)圖1。將其單菌落用接種環(huán)移至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再以1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)定30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h后再離心，取上清液進(jìn)行酶活的測(cè)定，得出酶活為16.91 U/L。

圖1 平板透明圈Fig.1 Plate transparent zone

2.2 菌株CZW003的鑒定

2.2.1 菌株CZW003的形態(tài)學(xué)特征

菌株CZW003的形態(tài)學(xué)觀察見(jiàn)圖2。

圖2 菌株CZW003的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain CZW003

由圖2中a可知，通過(guò)革蘭氏染色觀察，此菌株為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，短桿狀。在篩選培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)的形態(tài)：菌落較小呈淺黃色，表面光滑濕潤(rùn)，有黏性，不透明，微凸易挑取(見(jiàn)圖2中b)。

2.2.2 生理生化特征

對(duì)菌株CZW003進(jìn)行16項(xiàng)生理生化特征測(cè)定。其中β-半乳糖苷酶、氧化酶、VP反應(yīng)和明膠水解均為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)、脲酶和產(chǎn)生H2S均為陰性，具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化特征初步鑒定為S.nitritireducens。

表1 菌株CZW003的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain CZW003

2.2.3 菌株CZW003的16S rDNA擴(kuò)增與分析

將菌株CZW003的DNA作為模板DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列上傳GenBank(登錄號(hào)：MW435380)，用BLAST與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有核糖序列進(jìn)行種屬同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與Stenotrophomonasnitritireducens(登錄號(hào)NR 025305.1)的同源性最高，一致性達(dá)到96%，從中選擇親緣關(guān)系相近的菌株，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖3)，做比對(duì)分析得出菌株CZW003與S.nitritireducens在同一支且親緣關(guān)系最近，因此將菌株CZW003鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)的還原亞硝酸鹽寡養(yǎng)單胞菌。

圖3 菌株CZW003的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Molecular evolutionary tree of strain CZW003

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用DNS法繪制菌株CZW003幾丁質(zhì)酶酶活的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。得到線性方程y=2.328 4x-0.004 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，契合度較高。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of glucose

2.3 酶學(xué)特性研究

2.3.1 酶的最適溫度

在設(shè)定的不同溫度條件下，測(cè)定其酶活力。由圖5可知，溫度在35 ℃時(shí)酶活力最高，并設(shè)為酶活100%，在35～65 ℃之間酶活呈急劇下降趨勢(shì)，隨著溫度升高，酶逐漸變性失活；相比之下，在5～35 ℃之間酶活的下降趨勢(shì)較為緩慢，在15 ℃時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到60%以上，且在5 ℃仍有催化活性，說(shuō)明該酶具有較強(qiáng)的冷適應(yīng)性。

圖5 溫度對(duì)菌株CZW003產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of chitinase produced by strain CZW003

2.3.2 溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響

圖6 溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of enzyme activity

將菌株CZW003在6個(gè)不同溫度環(huán)境下同時(shí)放置在恒溫水浴鍋中，分別將6個(gè)不同溫度的初始酶活設(shè)為100%，每間隔0.5 h分別測(cè)定其酶活力，并計(jì)算其相對(duì)酶活。由圖6可知，菌株CZW003在溫度5～35 ℃下，酶活變化較穩(wěn)定，尤其在5 ℃和15 ℃溫度下水浴保溫3 h后相對(duì)酶活仍能保持在70%以上，在55 ℃水浴1 h后酶活急劇下降，3 h后已低至20%以下，說(shuō)明該酶在低于35 ℃下具有良好的酶活穩(wěn)定性。

2.3.3 酶的最適pH

圖7 pH對(duì)菌株CZW003產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活的影響Fig.7 Effect of pH on the enzyme activity of chitinase produced by strain CZW003

設(shè)定pH值分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，測(cè)定其酶活力。由圖7可知，當(dāng)pH為6.0時(shí)，酶活力最高并設(shè)為酶活100%，當(dāng)pH為5.0時(shí)，酶活仍達(dá)到90%以上。而當(dāng)pH>8.0時(shí)，酶活迅速降低，這是因?yàn)閜H過(guò)高破壞酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使酶受到不可逆的破壞，可見(jiàn)該酶最適pH為6.0。

2.3.4 pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響

圖8 pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on the stability of enzyme activity

將不同pH值的混合液在30 ℃恒溫水浴鍋中繼續(xù)放置12 h后，再分別測(cè)定其酶活力。由圖8可知，在混合液pH值為6.0時(shí)，酶活力最高并設(shè)為酶活100%。pH在 3.0～7.0酸性條件下，保溫12 h仍保持相對(duì)穩(wěn)定的酶活性，特別在pH 5.0和pH 3.0時(shí)，相對(duì)酶活分別保持在95%和80%以上，可見(jiàn)該酶是耐酸幾丁質(zhì)酶。

2.3.5 金屬陽(yáng)離子和EDTA對(duì)酶活的影響

向粗酶液中加入不同的金屬陽(yáng)離子和EDTA，并分別測(cè)定酶活力，將只加入蒸餾水的酶活設(shè)為100%，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 金屬陽(yáng)離子及EDTA對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of metal cations and EDTA on the enzyme activity

Mg2+、Ca2+、K+對(duì)酶活具有激活作用，而Hg+、Fe2+、Ag+及EDTA對(duì)酶活具有明顯的抑制作用。

2.3.6 底物對(duì)酶活的影響

因幾丁質(zhì)酶為底物誘導(dǎo)酶，所以分別選擇粉狀幾丁質(zhì)、殼聚糖、膠體幾丁質(zhì)作為底物，與粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，CZW003對(duì)不同底物的降解能力見(jiàn)圖10。

圖10 底物對(duì)酶活的影響Fig.10 Effect of substrates on the enzyme activity

由圖10可知，該酶有嚴(yán)格的底物特異性，對(duì)膠體幾丁質(zhì)的酶解能力顯著，而粉狀幾丁質(zhì)與殼聚糖的酶解能力很弱。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究的樣品來(lái)自連云港市風(fēng)景區(qū)連島海域的海泥，從中篩選出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株CZW003，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列擴(kuò)增分析，鑒定該菌株為S.nitritireducens。菌株CZW003產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適溫度為35 ℃，在低溫5 ℃下仍具有催化活性，在5～35 ℃之間具有較好的穩(wěn)定性；該酶的最適pH為6.0，在pH 3.0～7.0酸性條件下保持較強(qiáng)的酶活力，相對(duì)酶活達(dá)到80%以上；金屬陽(yáng)離子Mg2+、Ca2+、K+對(duì)該酶酶活具有促進(jìn)作用，而Hg+、Fe2+、Ag+及EDTA對(duì)酶活具有明顯的抑制作用，用膠體幾丁質(zhì)作為底物時(shí)酶活力最高。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該酶屬于低溫耐酸幾丁質(zhì)酶，能在低溫和酸性環(huán)境中發(fā)揮更好的作用，有利于嚴(yán)酷的工業(yè)發(fā)酵條件。該酶的獨(dú)特酶學(xué)特性為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。