紅三葉個體水平異黃酮含量的差異及其形態特征和草產量比較研究

郝 寧，張曉明，穆贏通，李曉杰，奧 運，王俊杰

(內蒙古農業大學草原與資源環境學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

紅三葉(TrifoliumpratenseL.)又名紅車軸草[1]，為豆科三葉草屬多年生草本植物，也是一種良好的多功能植物，具有營養價值高、適口性好、防止水土流失等特點。紅三葉可為家畜提供多酚氧化酶，提高家畜乳和肉中的不飽和脂肪酸的水平[2]，改善肉公雞的生長性能和肉質[3]，在北歐等地以飼用為栽培目標而廣泛種植；同時，紅三葉中還含有豐富的異黃酮類化合物，又稱紅三葉異黃酮(Red clover isoflavones,RCI)[4]，也被稱為“天然的雌激素”，具有預防骨質疏松、提高機體免疫力、降低絕經后婦女潮熱的頻率等功能[5～9]。近年來國內外許多學者對紅三葉異黃酮藥用功效進行研究發現，紅三葉的雌激素作用對帕金森患者的大腦有神經也保護作用[10]。此外，Ihsan等[11]研究表明紅三葉異黃酮可以通過增加成骨細胞增殖、刺激基質活性來增強人體成骨作用。目前對于紅三葉的研究主要聚焦于提高牧草營養品質、適口性及產量方面，對于紅三葉藥用活性成分對其農藝性狀及產量的影響研究較少。

紅三葉為異花授粉植株，具有自交不親和的特性，經過長期栽培或自然雜交后會存在一定程度的遺傳變異，產生不同的表型變異類型[12]，有些類型則表現出優異特性[13]。紅三葉生長類型、葉面積和莖長等形態特征存在明顯的差異[14]，可用于培育不同形態的品種，以適應不同用途[15]。張鶴山測定了來自國內外45份紅三葉種質材料的形態特征，發現紅三葉各表觀性狀在群體間和群體內具有不同程度的變異分化[16]。馬一鳴[17]對大田中16種紅三葉變異類型進行研究，結果表明，白花型紅三葉產量高于其他花色紅三葉，而高異黃酮含量紅三葉大多具有粉花和紫花的特征。

本試驗測定和林格爾縣試驗地300株紅三葉異黃酮含量，采用K-means聚類分析法，將不同異黃酮含量紅三葉聚類為4個類群(T1～T4)。對不同異黃酮含量的紅三葉群體進行形態特征觀測，對其農藝性狀和產量的各指標進行測定。目前針對個體水平的高異黃酮含量紅三葉選育研究較少，本研究通過比較紅三葉農藝性狀、產量、藥用成分之間的差異，為紅三葉高產優質栽培和品種選育提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗區概況

紅三葉材料取自內蒙古自治區呼和浩特市和林格爾縣大唐藥業試驗地(40°48′N,114°43′E)。試驗地海拔1 060 m，屬于中溫帶半干旱大陸性季風氣候，年平均氣溫6.2℃左右，早晚溫差較大，四季分明，具備良好灌溉條件。種植于2019年5月，于2021年6月以行距和株距均70 cm進行單株移栽，以10株×10株為一個小區，以便對每株紅三葉表型特征進行觀測以及各項指標的測定。

1.2 紅三葉異黃酮含量測定

于紅三葉開花期，在大田中隨機選取300株紅三葉植株，使用等吸光點紫外分光光度法對其異黃酮含量進行測定[18]。

1.3 紅三葉農藝性狀測定

對不同異黃酮含量的紅三葉群體于次年初花期和盛花期，使用卷尺測量其絕對株高和自然株高，3次重復[19]；用卷尺測定其自然狀態下的冠幅，重復3次，取其均值。每隔15天測定紅三葉絕對株高，計算其生長速度計算公式為：s=(l2-l1)/(t2-t1)。其中，t1和t2分別為測定前后兩次的時間，l1和l2分別為測定前后兩次的絕對株高[20]。使用葉面積儀對測定紅三葉葉面積[21]，3次重復。測定紅三葉葉重，計算其占總重的百分比，即為葉率。

1.4 紅三葉產量測定

對不同異黃酮含量的紅三葉群體于生長旺盛期，留茬高度3～5 cm刈割取樣，立即稱重，即為鮮重[22]，3次重復；將鮮草放入烘箱中，100oC烘干6 h，稱其重，3次重復，并計算鮮干比。

1.5 數據分析

使用R,Microsoft Excel,Spass Statistics 23軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 紅三葉異黃酮含量測定

對300株紅三葉植株(H1～H300)異黃酮含量進行測定，異黃酮含量的范圍為15.65～34.16 mg·g-1。其中，H1異黃酮含量最高(34.16 mg·g-1)，H300異黃酮含量最低(15.65 mg·g-1)，平均異黃酮含量為24.88 mg·g-1。為深入探索不同異黃酮含量紅三葉個體間的共性，對300株紅三葉異黃酮含量進行K-means聚類分析(圖1)，將其聚類為4個紅三葉群體(T1～T4)。其中，T1包含紅三葉個體H1～H56，占據18.67%，異黃酮含量為28.17～34.16 mg·g-1，此群體中紅三葉異黃酮含量較高；T2包含紅三葉個體H131～H199，占據23.00%，其異黃酮含量為23.10～24.99 mg·g-1；T3包含紅三葉個體H57～H130，占據24.66%，其異黃酮含量為25.14～27.86 mg·g-1；T4包含紅三葉個體H200～H300，占據33.64%，其異黃酮含量為15.65～22.93 mg·g-1，此群體中紅三葉異黃酮含量較低(表1)。

圖1 紅三葉個體水平異黃酮含量聚類分析圖

表1 4個紅三葉群體的異黃酮含量

2.2 不同異黃酮含量紅三葉形態特征觀測

紅三葉為異花授粉植物，由于其配子不親和性導致其表型變異類型眾多[17]，為探索異黃酮含量與紅三葉形態特征間的關系。對大田中紅三葉的表型特征進行觀測，發現紅三葉個體間葉片面積(M)及自然株高(L1)和絕對株高(L2)差值具有明顯差異。統計這兩個指標在T1～T4類型中的占比(表2)，發現高異黃酮含量紅三葉群體(T1)中L1-L2大于15 cm的個體占55.9%，大多表現為平臥型。低異黃酮含量紅三葉(T4)群體中，L1-L2介于7～15 cm的個體占53.9%，此類紅三葉株型大多表現為半直立型。高異黃酮含量紅三葉(T1)中葉片面積小于350 mm2占71.4%，低異黃酮含量紅三葉(T4)中葉片面積大于350 mm2占53.4%。T1、T2、T4群體中葉片面積小于350 mm2的紅三葉個體所占比例均更高，也可能是由于該大田紅三葉中葉片面積小于350 mm2的個體更多的原因而導致。

表2 4個紅三葉群體不同表型占比

2.3 不同異黃酮含量紅三葉農藝性狀比較

對4個紅三葉群體農藝性狀的各指標進行分析，結果如表3所示。4個紅三葉群體樣品中，初花期自然株高范圍為17.39～21.45 cm，盛花期自然株高范圍為20.50～29.45 cm。T4在初花期和盛花期兩個時期的自然株高最高(21.45 cm，29.45 cm),T3在兩個時期自然株高最低(15.93 cm，20.50 cm)。紅三葉樣品中初花期絕對株高范圍為27.20～33.68 cm，盛花期絕對株高范圍為38.93～44.49 cm。T4初花期的絕對株高最低(27.20 cm)，T3盛花期絕對株高最低(38.93 cm),T1初花期和盛花期絕對株高最高(33.68 cm，44.49 cm),4個紅三葉群體初花期冠幅范圍為43.28～50.37 cm，盛花期冠幅范圍為57.71～69.22 cm，T4在兩個時期冠幅最小(43.28 cm，57.71 cm)，T1初花期冠幅最大(50.37 cm)，T3盛花期冠幅最大(69.22 cm)，4個類型紅三葉中T4生長速度最快(0.95 cm·d-1)，T2生長速度最慢(0.75 cm·d-1)(P<0.05)。4個紅三葉群體葉率范圍為48%～70%，T1葉率顯著最高為70%(P<0.05)，T1群體平均葉面積顯著最小為317.07 mm2，T4平均葉面積顯著最大為477.92 mm2(P<0.05)，T2和T3葉面積無顯著差異。

表3 紅三葉農藝性狀比較

2.4 不同異黃酮含量紅三葉草產量比較

4個紅三葉群體中單株草產量存在顯著性差異(P<0.05)，結果如表4所示，4個紅三葉群體單株鮮草產量范圍為317.59～388.77 g，T1單株鮮重最重(388.77 g)，T2單株鮮重最輕(317.59 g);4個群體干重范圍為91.18～118.32 g，T1干重最重(118.32 g)，T2單株干重最輕(91.18 g)；鮮干比范圍為3.29～3.79，T4鮮干比最高(3.79)，T1鮮干比最低(3.29)；T1,T3,T4鮮重顯著高于T2(P<0.05)。T1干重顯著高于其他類型(P<0.05)。T1鮮干比顯著低于T2,T3,T4群體(P<0.05)，表明T1累積干物質能力較強，而T4較弱。

表4 紅三葉草產量比較

2.5 各指標間相關性分析

不同異黃酮含量的紅三葉類群各項生長指標與產量的相關性分析結果如表5所示，初花期自然高度和同時期絕對株高、冠幅、葉片面積都呈顯著負相關(P<0.05),與盛花期冠幅呈極顯著負相關(P<0.01)；初花期絕對高度與同時期冠幅及鮮干比呈極顯著正相關(P<0.01)，與葉率呈顯著正相關(P<0.05)，與葉片面積呈顯著負相關(P<0.05)；生長速度和鮮重呈極顯著正相關(P<0.01)，紅三葉葉率與異黃酮含量呈極顯著正相關(P<0.01)，葉片面積與干重和異黃酮含量呈顯著負相關(P<0.05)。葉率和葉片面積對異黃酮含量具有一定影響，葉片面積對紅三葉干重具有一定影響，而生長速度對紅三葉鮮重具有一定影響。因此，不同異黃酮含量的紅三葉對其草產量以及各項生長指標影響較大。

表5 各指標間相關性分析

3 討論

紅三葉異黃酮也被稱為“天然的雌激素”，目前紅三葉中已知的異黃酮化合物以芒柄花黃素、鷹嘴豆牙素、大豆苷元、染料木素為主[23]。女性絕經后所要經歷的潮熱現象最有效的治療方法即添加外源雌激素[8]，而紅三葉異黃酮便可代替此類外源雌激素[24]。馬勇等[25]研究表明紅三葉異黃酮可改善去卵巢大鼠內源激素不平衡的狀況、子宮形態結構和生理機能。本研究隨機選取大田中300株紅三葉，測定其地上部分的異黃酮含量。發現：大田中紅三葉異黃酮含量最高為34.16 mg·g-1，最低為15.65 mg·g-1，平均含量為24.88 mg·g-1，平均含量高于岷山縣紅三葉異黃酮含量。以異黃酮含量為依據，對300株紅三葉進行K-means聚類分析，可將其聚類為4個紅三葉類群(T1～T4)，其中T1約占18.67%、T2約占23.00%、T3約占24.66%、T4約占33.67%。

表型性狀受自身遺傳特性及環境因子共同影響，廣泛用于遺傳變異和多樣性、良種選育等研究中[13,26]，具有觀察明顯、調查簡便等優點[27]。由于紅三葉自交不親和的特性，紅三葉在栽培過程會出現大量的表型變異，這為利用表型標記選育紅三葉優良品種提供了基礎[28]。本研究對不同異黃酮含量紅三葉群體進行形態觀測，利用其形態學差異，為選育高異黃酮含量紅三葉新種質提供可行途徑。研究發現，大田中紅三葉的株型和葉面積存在明顯不同，將紅三葉自然株高和絕對株高差值分為3個等級以對應不同株型，葉片面積分為2個等級對應大葉型和小葉型紅三葉。發現直立型紅三葉在4個群體中所占比例接近；半直立型紅三葉在T4中所占比例最高為53.90%，在T1、T2、T3中所占比例接近；平臥型在T1中所占比例最高為55.9%，在T4中所占比例最低為23.00%；平均葉片面積小于350 mm2的紅三葉植株在T1中占71.40%、T2中占74.60%、T3中占44.40%、T4中占53.80%，平均葉片面積大于350 mm2紅三葉植株在T1中占28.60%、T2中占25.40%、T3中占55.60%、T4中占46.20%。這也可能是大田中平臥型和小葉型紅三葉占據比例更高的原因所導致，還有待后續深入研究。

鮮干比是反映牧草適口性的重要指標[29]，株高、冠幅、生長速度等農藝性狀是評價飼草生產性能的重要指標，直接影響飼草產量，本研究結果表明高異黃酮含量紅三葉類型(T1)的葉率顯著高于T2,T3,T4(P<0.05)。T1的干重顯著高于T2,T3,T4(P<0.05)，鮮干比也顯著最低(P<0.05)，說明T1積累干物質能力更強。使用相關分析發現，葉片面積對紅三葉干重影響較大，而生長速度對紅三葉鮮重影響較大，葉率對紅三葉異黃酮含量影響較大(P<0.01)。馬一鳴[17]測定紅三葉各器官中的異黃酮含量，研究結果表明葉片中異黃酮含量最高，與本研究葉率對異黃酮含量影響較大的結果也基本一致。

4 結論

本研究測定大田中300株紅三葉異黃酮含量，通過田間形態觀測，發現高異黃酮含量紅三葉大多具有絕對高度和自然高度差值大于15 cm、葉片面積小于350 mm2的特征，同時也具有更高的草產量。高異黃酮含量的紅三葉類群絕對株高和冠幅最大(P<0.05)。通過相關性分析發現葉率對紅三葉植株異黃酮含量影響較大。