添加麥麩和乳酸菌對川西北高寒地區燕麥裹包青貯品質和有氧穩定性的影響

李海萍, 關 皓，賈志鋒，劉文輝, 陳仕勇, 徐美玲, 陳生翠, 嚴東海, 蔣永梅, 甘 麗，張珈敏, 周青平

(1.青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室，青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2.西南民族大學四川若爾蓋高寒濕地生態系統國家野外科學觀測研究站，四川 成都 610041；3.青海師范大學數學與統計學院，青海 西寧 810016；4.海北州祁連縣林業和草原局，青海 祁連 810499；5.四川省草業技術研究推廣中心，四川 成都 610000)

川西北高寒區畜牧業以傳統天然草地放牧利用為主，受氣候變化和超載過牧等因素的影響，天然草地退化嚴重，生產力急劇降低，限制了該區域畜牧業轉型升級。該地區草產品單一、生產方式落后，冷季飼草不足一直是限制其草牧業發展的短板。因此，破解高寒區飼草季節性供應不足、草畜矛盾突出、養殖效益低下、畜產品附加值低等難題，要從根本上提高飼草種植、加工利用技術水平，從而實現生態效益、社會效益和經濟效益最大化，并與時俱進發展高寒區草地生態畜牧業。

燕麥(Avenasativa)是禾本科一年生糧飼兼用作物，喜冷涼、耐貧瘠、營養價值高、緩沖能值低，是高寒地區牧民利用“圈窩子”生產“抗災保畜”優質飼草的主導品種，在高寒地區畜牧業穩定發展中發揮重要作用[1]。傳統上，農牧民在夏末秋初刈割牧草，就地曬制青干草，但是燕麥干草制作過程中受不良天氣影響，容易出現霉菌滋生、腐爛等現象，造成燕麥營養成分的損失。青貯是以青綠飼草為原料，在厭氧條件下由乳酸菌發酵調制成的優質青粗飼料，可有效的保持原料的干物質、粗蛋白、可溶性碳水化合物等營養成分，降低酸性洗滌纖維等不易被消化的成分，提高飼料的利用率[2]。燕麥本身附生的乳酸菌數量較少，且品種間差異明顯[3]，而乳酸菌的種類和數量是決定青貯發酵能否成功的關鍵因素[4]。加之川西北地區降雨量充沛[5]，燕麥收獲時含水量較高、易滋生腐敗菌[6]，如何降低水分且快速啟動乳酸發酵是當地高品質青貯生產亟待解決的問題。麥麩作為主要的小麥副產品，其干物質、粗蛋白和灰分含量相對較高，粗纖維含量相對較低，與燕麥混合青貯過程中即可以增加蛋白質來源，又可以調節水分，發揮雙重作用。隨著對優質低成本飼料需求的增加以及資源整合的倡導，農副產品和食品加工副產品越來越受到重視，麥麩在青貯飼料的應用將有效緩解“人畜爭糧”的問題[7]。

本研究擬明確自選乳酸菌株生長、產酸特性，通過燕麥裹包青貯評價添加自選乳酸菌和麥麩對燕麥青貯發酵品質和營養品質的影響，為川西北高寒牧區高品質燕麥青貯生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗的青貯原料為燕麥，于2021年7月28日收獲于四川省紅原縣瓦切鎮的唐日牦牛養殖農民專業合作社(33°06′N，102°37′E，海拔3 492 m)，刈割時期為開花期。

供試的乳酸菌為植物乳桿菌160(LP160,Lactobacillusplantarum，CGMCCNo.23166，由團隊前期篩選)、短乳桿菌248(LB248,Lactobacillusbrevis，CGMCCNo.23167，由團隊前期篩選)和商業菌(Commercial inoculants，COM，臺灣亞芯生物科技有限公司，活性菌為植物乳桿菌，活菌數為1010cfu·g-1)。麥麩購買自佳惠飼料(河北石家莊)。

1.2 乳酸菌菌株特性測定

1.2.1乳酸菌菌株生長曲線和產酸曲線的測定 活化好的菌株按照5%(v∶v)的接種量接種到MRS液體培養基中，分別放置于37℃和20℃/-5℃兩個溫度條件下培養36 h，每個處理設置3個重復，每2 h取培養液用酶標儀(賽默飛Multiskan Go，賽默飛世爾科技(中國)有限公司，中國上海)在600 nm下測吸光度值(Optical density,OD)并使用pH計(雷磁pHS-3C，上海儀電分析儀器有限公司，中國上海)測pH，連續測量36 h。

1.2.2乳酸菌菌株綠汁發酵液pH測定 將灌漿期燕麥榨汁，用無菌醫用紗布過濾后收集到50 mL滅菌離心管中，對于事先活化好的菌株按照5%(v∶v)接種量接種于綠汁發酵液中，分別放置在37℃和20℃/-5℃(先20℃,12 h后-5℃,12 h反復交替)的培養箱中連續培養60 h，設置3個重復，分別在4,8,16,24,60 h時測量綠汁發酵液的pH。

1.3 燕麥裹包青貯調制

采用雙因素試驗設計，A因素為麥麩，設2個水平，A0：0%麥麩；A1：30%麥麩。B因素為乳酸菌類型，設4個水平，B0：對照(噴施等量的滅菌蒸餾水)；B1：LP160植物乳桿菌；B2：LB248短乳桿菌；B3：青貯商業菌,共8個處理(表1所示)。

表1 試驗處理編號

燕麥于開花期刈割，留茬高度10 cm，切短成2～3 cm左右。分別向單獨燕麥原料與燕麥和麥麩以7∶3混合原料上均勻噴灑植物乳桿菌160(LP160)、短乳桿菌248(LB248)和商業菌，按照活菌數為106cfu·mL-1，裝入噴壺，以每1 kg原料噴灑30 mL菌液為標準添加，對照添加等量的滅菌蒸餾水。將原料與乳酸菌添加劑充分混勻后放入全自動青貯打捆包膜一體機，制作成50 kg·個-1的裹包青貯，放置當地室內(-8℃～20℃)發酵60 d，每個處理3個重復。待發酵完成后，打開裹包，每個裹包隨機取4個點樣品，混勻后取20 g青貯樣品與180 mL滅菌蒸餾水混合在4℃冰箱中靜置24 h制作浸提液用于測定pH、氨氮(NH3-N)、有機酸。取約300 g樣品在65℃烘箱(電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9053A，上海維菱)中烘干至恒重，粉碎機粉碎，過40目篩后測量相關指標。

1.4 有氧穩定性的測定

青貯60 d后，每個裹包隨機在4個點取樣，混勻后取1 kg于2 L滅菌燒杯中壓實，用兩層滅菌紗布覆蓋，每個處理3個重復，放置在室溫下，連接實時溫度記錄儀(MT-X，神華科技有限公司，中國深圳)，每5 min測量一次核心區域溫度，持續2 d，7 d后取20 g青貯樣品與180 mL滅菌蒸餾水混合靜置24 h制作浸提液用于測定pH。有氧穩定性的計算基于有氧暴露后青貯飼料核心溫度超過基準環境溫度2℃所持續的時間[8]。

1.5 測定指標及方法

1.5.1青貯飼料營養成分測定 干物質(Dry matter,DM)含量采用65℃烘箱(電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9053A，上海維菱)烘干至恒重測定[9]；粗蛋白(Crude protein,CP)含量采用FOSS全自動凱氏定氮儀測定[10]；粗脂肪(Ether extract,EE)含量采用石油醚浸提通風揮發后稱重的索氏提取法測定[11]；灰分(Ash)含量采用電爐低溫碳化后用馬弗爐灼燒測定[12]；中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量采用Van Soest法測定[13]；淀粉(Starch)含量采用植物淀粉含量試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司，中國蘇州)測定。水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)采用植物可溶性糖含量試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司，中國蘇州)測定含量。

1.5.2青貯發酵特性測定 pH采用pH計(雷磁pHS-3C，上海儀電分析儀器有限公司，中國上海)測定；氨態氮(NH3-N)含量通過浸提液處理后采用苯酚-次氯酸鈉法測定[14]；有機酸包括乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)，采用超高效液相色譜儀(賽默飛UltiMate3000,美國)測定其含量，將浸提液通過0.22 μm濾頭過濾到進樣瓶中，色譜條件為：RSpak KC-811色譜柱，流動相0.1% H3PO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫55℃。

1.6 統計分析

采用Excel 2016和SPSS 26.0進行數據統計分析，先利用Excel2016對數據進行預處理，再利用SPSS 26.0進行雙因素方差分析，再結合鄧肯氏(Duncan′s)方法進行處理間多重比較，其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株生長曲線和產酸曲線的測定

由圖1可見，恒溫37℃條件和反復凍融條件下，菌株的生長曲線呈現不同的變化趨勢。37℃條件下，菌株LP160和LB248快速生長，在14 h時進入穩定期而商業菌生長緩慢且OD值始終小于LP160和LB248。在凍融條件下菌株均生長緩慢且在-5℃時出現了明顯的停滯期，溫度重新升到20℃時菌株再次恢復生長，商業菌生長緩慢且OD值低于LP160和LB248。在兩個處理條件下LB248菌株表現出了較快的生長速度菌株的產酸曲線與生長曲線呈負相關(圖2)，菌株LP160和LB248表現出相似的變化趨勢。37℃條件下，菌株LP160和LB248的pH迅速下降，在14 h時降到最低，商業菌pH下降緩慢且pH始終高于LP160和LB248，LP160、LB248和商業菌的最終pH分別是3.45，3.55和3.79。凍融條件下，pH下降較緩慢，在-5℃階段出現了停滯期，溫度切換到20℃階段時pH繼續下降，商業菌的pH始終高于LP160和LB248，LB248，LP160，LB248和商業菌的最終pH分別是3.90，3.84和4.38。

圖1 乳酸菌菌株不同溫度下的生長曲線

圖2 乳酸菌菌株不同溫度下的產酸曲線

2.2 乳酸菌菌株在凍融條件下的綠汁發酵液測定

如圖3所示，在凍融條件下將菌株接種到燕麥綠汁發酵液后，各菌株表現不同，LB248和商業菌的pH在前24 h下降極少，而LP160下降較快，經過24 h發酵后，接種LP160的綠汁發酵液pH已降低到4.13，而LB248和商業菌接種的綠汁發酵液pH分別是5.64和5.83。60 h后，接種LP160LB248和商業菌的綠汁發酵液的pH分別是3.91,4.04和4.38，商業菌的pH高于LP160和LB248的pH。

圖3 接種乳酸菌菌株后燕麥綠汁發酵液pH曲線

2.3 青貯原料特性

青貯前新鮮燕麥的干物質含量為23.69%鮮重(Fresh weight,FW)，粗蛋白為10.02% DM，中性洗滌纖維為52.17% DM，酸性洗滌纖維為30.69%，水溶性碳水化合物為7.89% DM。附生的乳酸菌、腸桿菌、酵母菌和霉菌分別為3.45，3.19，2.56，3.29 log cfu·g-1FW(表2)。

表2 燕麥青貯原料特性

2.4 麥麩和乳酸菌協同作用對燕麥青貯品質的影響

表3可知，A0B0的pH極顯著高于其他處理組(P<0.01)，A1B0的pH極顯著高于A1B1，A1B2，A1B3(P<0.01)，說明接種乳酸菌顯著降低了燕麥青貯的pH。A0B1，A0B2，A0B3的pH均低于A1B1，A1B2，A1B3，可見添加麥麩后，接種乳酸菌pH降低較少。A0B1，A0B2，A0B3的NH3-N/TN含量均極顯著低于A1B1，A1B2、A1B3(P<0.01)，其中A0B1的NH3-N/TN含量均極顯著低于其他處理組(P<0.01)。A0B1的乳酸含量極顯著高于其他處理，A1B0的乙酸含量均極顯著高于其他處理(P<0.01)。因此,A0B1的發酵特性最優。由雙因素方差分析可見，pH，NH3-N/TN和乙酸的含量與麥麩和乳酸菌及其交互作用均顯著相關(P<0.05)，而乳酸含量與麥麩無相關性。

表3 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯發酵品質的影響

表4可知，A1B0，A1B1，A1B2和A1B3的DM，CP含量均極顯著高于A0B0，A0B1，A0B2和A0B3(P<0.01)，其中A1B1的DM、CP和淀粉含量最高，極顯著高于其他處理(P<0.01)。A0B0的WSC含量低于其他處理組，而A0B1的WSC含量最高。A1B1的NDF、ADF均低于其他處理，而A1B2的ADF和NDF最高；由此可見，麥麩和乳酸菌共同作用對燕麥青貯營養品質影響大，添加麥麩后干物質和粗蛋白含量顯著增加(P<0.01)，其中A1B1提高燕麥青貯營養品質效果最為明顯。根據方差分析可知，除灰分、粗脂肪、可溶性碳水化合物外，其余營養指標與麥麩、乳酸菌及麥麩和乳酸菌互作都顯著相關(P<0.05)，可溶性碳水化合物與乳酸菌極顯著相關(P<0.01)，與麥麩和乳酸菌互作顯著相關(P<0.05)。

表4 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯營養品質的影響

2.5 添加麥麩和乳酸菌對燕麥青貯有氧穩定性的影響

經有氧暴露兩天后，各個處理的pH如圖4所示，A1B2處理的pH最高，A0B1處理的pH最低，添加麥麩后燕麥青貯的pH顯著降低(P<0.05)。在不添加麥麩條件下，接種LP160和LB248顯著降低燕麥青貯pH；添加麥麩后LP160和商業菌顯著降低pH(P<0.05)。因此，無論添加麥麩與否，接種LP160的燕麥青貯有氧暴露階段的pH都顯著低于對照。

圖4 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯有氧暴露兩天后pH的影響

如圖5所示，通過有氧暴露實驗確定了有氧穩定性時間，接種乳酸菌和麥麩后有氧穩定性顯著增加(P<0.05)，A0B1>A1B1>A0B2>A1B3>A1B0>A0B0>A0B3>A1B2，其中LP160 效果最優，是對照的近2倍。LB248在不加和添加麥麩后有氧穩定性時間分別是127.33 h和55.67 h。所有處理的有氧穩定性均超過了2 d。

圖5 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯有氧穩定性的影響

3 討論

3.1 乳酸菌對燕麥青貯和有氧穩定性的影響

乳酸菌是有利于青貯保存的微生物，它在厭氧條件下發酵水溶性碳水化合物并產生乳酸，降低pH，從而抑制其他有害微生物的生長[15]。本研究單獨接種自選乳酸菌明顯改善發酵品質，且有氧暴露兩天后，pH仍維持在5.0以下，尤其LP160效果最優，有氧穩定性顯著高于其他處理，自選乳酸菌效果均優于商業菌，這就說明雖然乳酸菌具有革蘭氏陽性，不產生孢子，過氧化氫酶陰性，耐酸，喜歡在厭氧條件下生長等共同點[16]，但是由于環境的不同，附生植物的不同，不同的菌株有不同的特性[17-19]，而因地制宜篩選出的乳酸菌作用更優，這與張紅梅等[20]的研究結果一致。根據乳酸菌對碳水化合物的代謝，將其分為同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌，前人研究發現與未經處理的對照相比，接種植物乳桿菌和布氏乳桿菌提高了乳酸菌和乳酸的含量，降低了pH值和丁酸、2，3-丁二醇及乙醇的水平，提高了發酵品質且抑制了有氧變敗的發生[21-22]，這與本研究結果一致。但是，有氧暴露兩天后，LP160處理的pH顯著低于LB248處理，這與前人[21,23]研究的異型發酵乳酸菌更有利于有氧穩定性的結果不一致，且LB248與麥麩混合作用時，有氧穩定性反而降低，這可能與菌株特性有關，有待進一步探究。另外，高原上晝夜溫差大，青貯期間還會遇到凍融情況[24]，自選菌株LP160和LB248即使在20℃/-5℃條件下也能快速生長且產酸，能夠在高寒區燕麥青貯中發揮重要作用。

3.2 麥麩對燕麥青貯和有氧穩定性的影響

紅原地區燕麥收獲季往往降雨量較大，使得青貯含水量較高，而干物質含量是決定青貯能否成功的一個重要因素[25]，干物質含量過低則容易引起梭菌發酵，產生大量丁酸，導致青貯失敗。麥麩作為小麥制粉的副產物，產量約占小麥制粉量的20%，且含有粗蛋白質、淀粉、粗脂肪、粗纖維、以及維生素、阿拉伯木聚糖等營養物質[26-27]。而CP,NDF,ADF是評價青貯飼料營養的主要指標，飼料營養成分中粗蛋白含量相對越多，NDF、ADF含量相對越少，飼料營養品質更好[28]。青貯飼料的發酵是否成功也與WSC含量密切相關，是保證青貯飼料發酵成功的必要條件之一[29]。杜昭昌等[30]發現麥麩和鮮玉米秸稈混合青貯的DM、CP、WSC含量比鮮玉米秸稈單獨青貯高。本試驗結果與上述結果一致，添加麥麩后DM、WSC和CP含量顯著增加，NDF和ADF降低，表明添加麥麩可以提高燕麥青貯營養品質。另外，添加麥麩后，pH、氨態氮降低，乳酸和乙酸含量增加，說明麥麩在一定程度上改善了發酵品質，可能是添加麥麩后含水量降低，抑制了雜菌生長，從而起到促進發酵的作用。研究發現高干物質青貯開窖后的有氧穩定性要優于低干物青貯，而本研究中通過添加麥麩降低了含水量，進而增加了有氧穩定性，本文與上述研究結果一致[31]。

3.3 乳酸菌與麥麩互作對燕麥青貯和有氧穩定性的影響

麥麩中的總碳水化合物含量為50%～60%，主要包括淀粉多糖和非淀粉多糖。前者可被畜禽消化吸收以供能，后者作為麥麩中碳水化合物的主要成分，以高聚合態的半纖維素和纖維素形式存在，難以被畜禽消化利用[26]。Spaggiaria等[32]利用鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株對小麥麩皮進行固態發酵，并評估其對生物活性化合物(游離和結合酚酸)和抗氧化活性的影響，發現乳酸菌處理會改變其纖維結構和營養特性。本研究采用乳酸菌和麥麩互作，發現不同菌株的作用不同，LB248提升了發酵品質增加但中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，而且有氧暴露兩天后pH更高，而LP160的效果更好，產生了協同效應，混合使用后營養品質最優，這一方面可能是因為LP160能夠分解纖維而LB248不具有這種特性，另一方面可能是不同菌株與麥麩混合有不同的適應比例，而LB248與麥麩混合的比例失衡，造成營養流失。有氧暴露后各個處理的有氧暴露時間均超過了2 d，實踐中，裹包青貯從開包到飼喂完成通常最多需要1～2 d，所以添加麥麩和乳酸菌可以保證飼喂品質。

4 結論

本研究通過在燕麥青貯中添加麥麩和自選乳酸菌，發現添加麥麩和乳酸菌都能一定程度的提高燕麥青貯的營養品質和發酵品質，其中，添加LP160和麥麩的燕麥青貯飼料營養品質最優；添加LP160的燕麥青貯飼料發酵品質最優且有氧穩定性最好，因此，建議在生產實踐中，條件允許可混合添加麥麩和乳酸菌菌劑；條件有限可單獨添加乳酸菌菌劑。