乳酸菌和糖蜜對構(gòu)樹葉青貯品質(zhì)和細(xì)菌多樣性的影響

孫 蓉，劉 悅，陳 婷，呂仁龍，周漢林，李 茂*，字學(xué)娟*

(1.海南大學(xué)林學(xué)院，海南 儋州 571737；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江試驗站，廣東 湛江, 524000)

近年來我國畜牧業(yè)發(fā)展迅速，飼料需求增大，飼料供給不足限制了畜牧業(yè)的發(fā)展，因此，開發(fā)新的飼料資源十分必要[1]。構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)，廣泛分布在我國溫帶、熱帶地區(qū)，具有生物量大、生長快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。構(gòu)樹嫩枝葉營養(yǎng)價值高，可作為新型的飼料資源，開發(fā)構(gòu)樹飼料有利于緩解我國飼料短缺問題。但構(gòu)樹含有單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響動物適口性和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，研究表明對構(gòu)樹葉進(jìn)行青貯處理，可以提高構(gòu)樹葉適口性和飼用價值[3]。然而構(gòu)樹葉本身附著的乳酸菌很少，且粗蛋白高，含糖低，難以調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯飼料，為了改善構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)和提高其營養(yǎng)價值，可在青貯時添加糖蜜和乳酸菌[4-5]。外源乳酸菌的加入有利于快速產(chǎn)生乳酸，降低pH值抑制不良微生物生長，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，使原料得以長期保存[4-6]。糖蜜主要成分是蔗糖，常被用來當(dāng)作乳酸菌的發(fā)酵底物應(yīng)用于飼草青貯調(diào)制[6]。糖蜜可促進(jìn)青貯發(fā)酵使飼料中的乳酸菌產(chǎn)乳酸從而降低pH值，并抑制丁酸產(chǎn)生和防止原料蛋白水解，進(jìn)而提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[7]。糖蜜和乳酸菌在構(gòu)樹青貯中應(yīng)用已有報道，對改善發(fā)酵品質(zhì)和提高飼用品質(zhì)均具有積極作用[3-5]。但關(guān)于構(gòu)樹青貯微生物多樣性的研究報道較少，糖蜜和乳酸菌對構(gòu)樹青貯微生物組成的影響尚不明確。為保證構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)，深入了解青貯細(xì)菌的組成和豐度亦非常必要。因此，本研究采用16S高通量測序技術(shù)研究添加糖蜜、乳酸菌對構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌群落組成影響，為構(gòu)樹葉青貯飼料的加工調(diào)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

構(gòu)樹于2019年6月從海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所畜牧基地采集，構(gòu)樹嫩莖葉在采摘后用電動鍘草機(jī)切碎至2～3 cm，再進(jìn)行3.5小時的晾曬處理后備用。乳酸菌添加劑為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，活菌數(shù)≥1×1010cfu·g-1，由日本國際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心蔡義民研究員提供)，糖蜜為工業(yè)廢棄物。

1.2 試驗設(shè)計

實(shí)驗共有四個處理組，直接青貯為CK組、糖蜜為M組(2%，F(xiàn)M)、乳酸菌為L組(1×106cfu·g-1，F(xiàn)M)、糖蜜和乳酸菌混合添加為ML組(添加量同上)，每組3個重復(fù)，構(gòu)樹葉和添加劑充分混勻后裝入專用塑料青貯袋中，抽真空后室溫存放30天后，打開青貯袋，取樣分析各項指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1營養(yǎng)成分測定 取青貯材料200 g左右放置于信封內(nèi)，將其放入105℃干燥箱中20 min左右，最后再放入65℃的烘箱中烘48個小時，烘干多余的水分至恒重，待自然冷卻后進(jìn)行磨粉裝樣，用作營養(yǎng)成分測定。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)測定 青貯后開封，稱取50 g混合均勻的構(gòu)樹葉青貯料，放入燒杯中，并加入200 mL蒸餾水置于4℃冰箱內(nèi)浸取24小時，拿出燒杯對浸液進(jìn)行過濾，濾液裝入塑料管中蓋緊，放入離心機(jī)離心后取出，一部分用于測定青貯發(fā)酵指標(biāo)，另一部份放入-80℃液氮保存用于微生物多樣性分析[8]。其中pH值用pH計測儀進(jìn)行測定，乳酸、乙酸、丙酸、丁酸按照Li等[9]方法進(jìn)行測定。

1.3.3微生物多樣性分析測定 本研究中青貯微生物測序及分析由北京百邁客生物科技有限公司協(xié)助完成。將上述每一組的三個重復(fù)樣本均勻混合后經(jīng)過處理提取樣本DNA，PCR擴(kuò)增選用細(xì)菌16S rRNA(V3+V4)區(qū)域通用引物，具體序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，5′-GGACTAC-HVGGGTWTCTAAT-3′，再通過高通測序技術(shù)的雙末端測序方法，構(gòu)建片段文庫進(jìn)行測序，微生物測序是基于Illumina HiSeq測序平臺，采用雙末端測序(Paired-End)，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序，并對結(jié)果進(jìn)行分析，包括Alpha多樣性指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))、beta多樣性分析、微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)分析[8-10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

青貯微生物生物信息分析和作圖在百邁客云平臺(www.biocloud.net)完成。青貯發(fā)酵指標(biāo)采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并采用SAS 9.3軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對構(gòu)樹葉青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表1可知，糖蜜的使用能降低構(gòu)樹葉青貯的pH值(P<0.05)，糖蜜與乳酸菌混合使用降低pH值的效果低于單獨(dú)使用糖蜜；與CK相比，添加處理均能顯著提高構(gòu)樹青貯飼料乳酸含量(P<0.05)；所有添加處理組的乙酸(P<0.05)、丙酸含量均降低，其中，M組的丙酸含量下降較明顯(P<0.05)，本研究中，所有添加處理組均未檢出丁酸。綜上，添加糖蜜及糖蜜、乳酸菌混合的構(gòu)樹葉青貯效果優(yōu)于直接青貯，亦優(yōu)于乳酸菌單獨(dú)添加處理。其中，單獨(dú)添加糖蜜的青貯飼料發(fā)酵效果最好。

表1 構(gòu)樹葉青貯發(fā)酵品質(zhì)

2.2 構(gòu)樹青貯α多樣性分析

構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌多樣性如表2所示，Shannon指數(shù)值越大表明微生物多樣性越高，M組的微生物多樣性最高，其次是ML組，CK組和L組最低且相同。Simpson指數(shù)值越小表明菌群豐度越高，菌群豐度從高到底依次為M組、ML組、CK組、L組。與對照組(CK)相比，乳酸菌(L)的添加使構(gòu)樹葉青貯的細(xì)菌環(huán)境菌群豐度降低。糖蜜(M)及糖蜜、乳酸菌混合(ML)的添加，使構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌多樣性及豐度提高。

表2 構(gòu)樹葉青貯α多樣性指數(shù)

如圖1所示，構(gòu)樹葉青貯的OTU聚類分析共有111個不同的OTU被檢測到，從OTU貢獻(xiàn)數(shù)量來看，糖蜜、乳酸菌混合(ML)組的OTU數(shù)量最高，有109個，糖蜜(M)組的OTU數(shù)量107個，對照組(CK)組的OTU數(shù)量為106，乳酸菌(L)組的OTU數(shù)量為105個，說明ML組的細(xì)菌種類豐度最高。同時對四個處理組做OTU韋恩圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)四個處理組共享的OTU為101個，對照組(CK)和乳酸菌(L)組特有的OTU為0，糖蜜(M)組特有的OTU為1個，糖蜜和乳酸菌混合(ML)組特有的OTU為2個，說明M組和ML組均產(chǎn)生獨(dú)特的群落差異。

圖1 構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌群落OTU分析和韋恩圖

2.3 β多樣性分析

通過PCA分析不同處理OTU組成反映樣本間的差異，不同色點(diǎn)代表不同處理，不同色點(diǎn)之間的距離越近，表明不同處理之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性越高。由圖2可知，PC1成分的貢獻(xiàn)率為89.49%，PC2成分的貢獻(xiàn)率為3.53%。M組點(diǎn)與其他組距離較遠(yuǎn)，說明其菌群結(jié)構(gòu)組成與其他三組差異較大。CK與L組相對較靠近，表明兩組之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似。ML較為分散，其中有兩點(diǎn)距離其他組均較遠(yuǎn)，說明ML組與其他三組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。

圖2 構(gòu)樹葉青貯β多樣性分析

2.4 構(gòu)樹葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖3(A)所示，構(gòu)樹葉青貯飼料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為四個處理組的優(yōu)勢菌門。其中厚壁菌門相對豐度最高是M組(68%)，接著是CK組(53%)、ML組(46%)、L組(44%)，變形菌門相對豐度由高到低依次為L組(51%)、ML組(47%)、CK組(42%)、M組(29%)。其他菌門包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)，其相對豐度在四個處理組中均不足7%。M組厚壁菌優(yōu)勢明顯說明在構(gòu)樹葉青貯中，添加糖蜜可以增加厚壁菌門相對豐度，降低變形菌門相對豐度。

如圖3(B)所示，CK組的優(yōu)勢菌為魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)，相對豐度分為34%，27%和17%。L組的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬(Weissella)和腸桿菌屬(Enterobacter)，相對豐度分別為37%，33%。M組的優(yōu)勢菌是乳桿菌屬，相對豐度為64%。ML組的優(yōu)勢菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和魏斯氏菌屬(Weissella)，相對豐度分別23%，32%，19%。其他菌屬包括泛菌屬(Pantoea)、埃希氏-志賀菌(Escherichia-Shigella)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、氣球菌屬(Aerococcus)等，其相對豐度在四個處理組中均不超于10%。M組中乳桿菌屬為顯著優(yōu)勢菌屬，說明添加糖蜜可以提高乳桿菌屬的相對豐度，降低腸桿菌屬、魏斯氏菌屬及其他菌屬的相對豐度。

圖3 構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌群落組成(門和屬水平)

2.5 不同添加劑處理對青貯菌群豐度的影響

由圖4(A)可知，在門水平上，四組處理相對豐度較高的兩種細(xì)菌是厚壁菌門和變形菌門。與CK組相比，M組厚壁菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)，而變形菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)；相反，L和ML組的厚壁菌門相對豐度降低，變形菌門相對豐度提升。不同添加處理對構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌相對豐度的影響存在明顯差異，由圖4(B)可知，在屬水平上，相對豐度較高的菌屬為魏斯氏菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬。與CK組相比，L組乳桿菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)，ML的乳桿菌屬相對豐度組則顯著提高(P<0.05)，M組的乳桿菌屬相對豐度極顯著提高(P<0.01)；M組的魏斯氏菌屬和腸桿菌屬相對豐度極顯著降低(P<0.01)，L組的腸桿菌屬相對豐度顯著上升(P<0.05)，ML組的魏斯氏菌屬相對豐度顯著下降(P<0.05)。由此可知，糖蜜(M)的單獨(dú)添加明顯改變了青貯細(xì)菌的菌群相對豐度，使乳桿菌屬大幅增加，腸桿菌屬、魏斯氏菌屬等不利菌顯著減少，有助于青貯發(fā)酵品質(zhì)的提升。

圖4 構(gòu)樹葉青貯細(xì)菌豐度差異分析

3 討論

3.1 乳酸菌和糖蜜對構(gòu)樹青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯發(fā)酵品質(zhì)是由pH值和乳酸等有機(jī)酸及多因素共同決定的[11]。優(yōu)良的青貯飼料含有較多的乳酸、丙酸以及少量的乙酸[12]。青貯飼料pH值低說明發(fā)酵效果好，反之越差，決定青貯飼料pH值下降的主要因素是乳酸和乙酸的含量，其中乳酸和乙酸的含量比是判斷青貯發(fā)酵好壞的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗中，糖蜜(M)及乳酸菌、糖蜜(ML)的混合添加使構(gòu)樹葉青貯的乳酸含量與對照組相比有顯著提高(P<0.05)，且乳酸∶乙酸比例均大于1，該乳酸含量比對青貯發(fā)酵具有改善作用，與王超等[13]研究結(jié)果一致。構(gòu)樹葉青貯飼料中添加糖蜜產(chǎn)生的乳酸最多，糖蜜的添加為乳酸菌發(fā)酵提供動力，使青貯飼料產(chǎn)生大量乳酸，進(jìn)而降低青貯料pH值，抑制有害菌的生長，保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量[14]。本實(shí)驗中，糖蜜和糖蜜、乳酸菌混合添加這兩個處理組對青貯發(fā)酵品質(zhì)提升有促進(jìn)作用，而乳酸菌添加處理對改善構(gòu)樹葉青貯發(fā)酵品質(zhì)沒有效果，說明發(fā)酵底物的缺乏對青貯發(fā)酵品質(zhì)的限制作用遠(yuǎn)大于乳酸菌數(shù)量的添加。華金玲等[15]研究結(jié)果也表明，乳酸菌單獨(dú)添加發(fā)酵效果不佳，為了提高發(fā)酵的質(zhì)量需要添加糖類。穆麟等[16]研究表明糖蜜的添加可以降低青貯料pH值，與本實(shí)驗研究結(jié)果一致。乳酸菌的添加增加了發(fā)酵飼料的乳酸菌數(shù)量，其生長需消耗大量的發(fā)酵底物產(chǎn)生乳酸，但構(gòu)樹原料本身含糖少，無法提供更多的發(fā)酵底物，糖蜜的添加則補(bǔ)足了發(fā)酵底物，促進(jìn)青貯飼料中的乳酸菌生長，而單獨(dú)添加乳酸菌不能起到促進(jìn)作用。

3.2 乳酸菌和糖蜜對青貯發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性的影響

青貯飼料發(fā)酵質(zhì)量的好壞很大程度上由微生物組成決定[17]。青貯飼料發(fā)酵過程中菌群的豐度和結(jié)構(gòu)的變化影響著青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分[18]。細(xì)菌群落組成對于控制發(fā)酵質(zhì)量非常重要，發(fā)酵過程實(shí)質(zhì)為乳酸菌與其他菌群間的動態(tài)變化[19]。充足的發(fā)酵基質(zhì)和乳酸菌數(shù)量是青貯過程中發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素[20]。青貯厭氧環(huán)境提供了乳酸菌生長條件，添加糖蜜為菌群生長提供了營養(yǎng)，使細(xì)菌快速繁殖，影響并改變青貯飼料的細(xì)菌結(jié)構(gòu)[21]。在門水平上，構(gòu)樹青貯菌群中四個處理組占絕對優(yōu)勢的是厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。Eikmeyer等[22]研究中發(fā)現(xiàn)，在飼草青貯過程中，厚壁菌門占比較大。McGarvey等人[23]認(rèn)為，苜蓿青貯飼料的主要優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和變形菌門。兩個研究均與本實(shí)驗結(jié)果一致。在屬水平上，乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)、腸桿菌屬(Enterobacter)在四個處理組菌群中占優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，一般青貯發(fā)酵過程乳桿菌屬為主要優(yōu)勢菌屬，與本實(shí)驗研究結(jié)果一致[24-25]。乳桿菌屬和魏斯氏菌屬通常能夠降低青貯環(huán)境的pH值，保證青貯發(fā)酵品質(zhì)，乳桿菌屬的作用效果更佳，而腸桿菌屬屬于不良菌，腸桿菌屬的相對豐度增加使青貯環(huán)境pH值上升，限制其他有益菌的生長，不利于青貯發(fā)酵。乳桿菌屬能夠產(chǎn)生乳酸，降低青貯環(huán)境pH值，在青貯發(fā)酵過程起重要作用。糖蜜添加組(M)的乳桿菌屬相對豐度比魏斯氏菌屬高，其原因可能是魏斯氏菌屬主要在發(fā)酵前期發(fā)揮作用，發(fā)酵后期因糖蜜水解后為乳桿菌屬生長提供營養(yǎng)條件，使得乳桿菌屬數(shù)量快速增長。本研究結(jié)果表明，糖蜜的加入使構(gòu)樹青貯pH值顯著下降(P<0.05)，由此可得出添加糖蜜后乳桿菌屬的相對豐度上升，對青貯有利，對改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)有明顯效果。張想峰等[26]認(rèn)為乳酸桿菌對青貯發(fā)酵起重要作用，楊楊等[27]認(rèn)為乳桿菌屬在青貯中，發(fā)揮著重要的作用，研究結(jié)果與本實(shí)驗一致。綜上研究結(jié)果可得，乳桿菌屬在青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中為優(yōu)勢細(xì)菌，在保證青貯發(fā)酵品質(zhì)中發(fā)揮主要作用。

4 結(jié)論

構(gòu)樹葉直接青貯品質(zhì)不佳，添加糖蜜或混合添加糖蜜、乳酸菌均能一定程度的改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，單獨(dú)添加乳酸菌對改善青貯發(fā)酵品質(zhì)未起到良好作用。另外，糖蜜的添加改變構(gòu)樹葉青貯飼料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使乳桿菌屬相對豐度升高，魏斯氏菌屬和腸桿菌屬相對豐度降低，利于青貯發(fā)酵。綜合考慮，構(gòu)樹葉青貯時單獨(dú)添加糖蜜便可獲得良好的效果。