慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎患者ITPA基因多態(tài)性與聚乙二醇干擾素抗病毒治療所致血小板減少癥相關(guān)性分析

鄧浩輝 樓燕 李曉強 邱玖香

聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)是慢性丙型肝炎(CHC)和慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治療的重要藥物之一，但其不良反應(yīng)顯著高于直接抗病毒藥物或核苷類藥物，限制了其臨床應(yīng)用。Peg-IFN抗病毒治療所致的血小板減少癥是其常見的不良反應(yīng)之一，常導(dǎo)致抗病毒治療過程中藥物的減量或停藥，是影響抗病毒療效的重要原因。國外學(xué)者的研究表明，CHC患者肌苷三磷酸酶(ITPA)基因多態(tài)性(SNP)與Peg-IFN抗病毒治療所致的血小板減少癥相關(guān)，但國內(nèi)未見報道，另外，在CHB人群也未見相關(guān)報道。本研究探討CHC和CHB患者肌苷三磷酸酶(ITPA)基因多態(tài)性(SNP)與Peg-IFN α-2b或α-2a抗病毒治療所致血小板減少癥的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

資料與方法

一、研究對象

本研究納入廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院2011年1月—2016年12月期間門診治療的92例CHC和87例CHB患者，納入的患者均有完整48周隨訪數(shù)據(jù)并保存全血或外周血單個核細(xì)胞(PBMC)樣本，CHC患者使用Peg-IFN α-2a(180 μg/周)或α-2b(80 μg/周)聯(lián)合利巴韋林(RBV)抗病毒治療，CHB患者使用Peg-IFN α-2a或α-2b單藥抗病毒治療。納入分析的患者符合年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》和《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及符合指南建議的抗病毒治療指征[1-2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并肝硬化、肝細(xì)胞癌、其他病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、藥物性肝炎和自身免疫性肝炎的患者。本研究已通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院倫理委員會審查，所有納入研究的患者均簽署知情同意書。

二、肌苷三磷酸酶(ITPA)基因rs1127354位點基因多態(tài)性檢測方法

(一)患者宿主基因組DNA的提取 使用QIAamp DNA Mini Kit核酸提取試劑盒(QIAGEN，德國)對患者的全血或PBMC樣本進(jìn)行DNA提取，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，已提取的DNA立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(二)PCR擴(kuò)增包含目的位點的基因片段 使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，具體引物序列參考我們前期的研究[3]，對包含ITPA基因rs1127354位點的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；7 2℃延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗證產(chǎn)物后送廣州英濰捷基公司進(jìn)行測序。

(三)序列分析 使用Geneious R10.0.5軟件進(jìn)行序列峰圖分析，并根據(jù)序列測序圖確定患者ITPA基因rs1127354位點SNP數(shù)據(jù)。

三、臨床數(shù)據(jù)收集

收集納入分析的使用Peg-IFN抗病毒治療患者4、8、12、24、36和48周的血小板變化情況，以及Peg-IFN藥物劑量調(diào)整情況的數(shù)據(jù)。

四、統(tǒng)計分析

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗，χ2檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)和多變量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者的一般資料

本研究納入的92例CHC患者中，男性65例(70.6%)，女性27例(29.3%)，平均年齡(39.5±11.4)歲，HCV RNA (6.4±1.3)lgIU/mL，53例(57.6%)使用Peg-IFN α-2a/RBV抗病毒治療，39例(42.3%)使用Peg-IFN α-2b/RBV抗病毒治療。納入的87例CHB患者中，男性63例(72.4%)，女性24例(27.6%)，平均年齡(37.3±11.5)歲，HBV DNA(5.9±1.4) lgIU/mL，HBeAg 抗原陽性54例(62.1%)，陰性33例(37.9%)，50例(57.5%)使用Peg-IFN α-2a抗病毒治療，37例(42.5%)使用Peg-IFN α-2b抗病毒治療。

二、患者ITPA基因rs1127354位點基因多態(tài)性

本研究納入的92例CHC患者中，ITPA基因rs1127354位點CC型55例(59.8%)，AC型31例(33.7%)，AA型6例(6.5%)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(χ2=0.322，P=0.570)。在87例CHB患者中，ITPA基因rs1127354位點CC型53例(60.9%)，AC型29例(33.3%)，AA型5例(5.7%)，也符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(χ2=0.151，P=0.698)。

因ITPA基因rs1127354位點AA型的例數(shù)較少，參考既往研究[4]，AC/AA型合并分析。以ITPA基因rs1127354位點SNP為分組，CHC和CHB患者ITPA基因rs1127354位點AA/AC型和CC型患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1和表2)。

表1 CHC患者rs1127354位點AA/AC型和CC型一般資料比較

表2 CHB患者rs1127354位點AA/AC型和CC型一般資料比較

三、ITPA基因rs1127354位點SNP與Peg-IFN治療所致血小板減少癥相關(guān)性分析

在CHC患者中，rs1127354位點AA/AC型在Peg-IFN/RBV治療后4周(F=6.195,P=0.015)和8周(F=4.304,P=0.015)血小板下降水平顯著高于CC型的患者，但12、24、36和48周AA/AC型和CC型血小板下降水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。在CHB患者中，rs1127354位點SNP與Peg-IFN抗病毒治療后各時間點血小板下降程度無顯著相關(guān)性(P均>0.05)。見表3和4。

表3 CHC患者治療過程中rs1127354位點AA/AC型和CC型血小板下降水平比較

表4 CHB患者治療過程中rs1127354位點AA/AC型和CC型血小板下降水平比較

四、ITPA基因rs1127354位點SNP與治療過程中Peg-IFN藥物減量的關(guān)系

在納入分析的92例使用Peg-IFN/RBV抗病毒治療的CHC患者中，28例患者在48周治療過程中有Peg-IFN藥物減量，包括16例(16/37, 43.2%)rs1127354位點AA/AC的患者和12例(12/55, 21.8%)CC型的患者，AA/AC型患者Peg-IFN藥物劑量減量的構(gòu)成比顯著高于CC型患者(χ2=4.796,P=0.029)。在納入分析的87例使用Peg-IFN抗病毒治療的CHB患者中，32例患者在48周的治療過程中有藥物減量，包括13例(13/34, 38.2%)rs1127354位點AA/AC的患者和19例(19/53, 35.8%)CC型的患者，但rs1127354位點SNP與Peg-IFN藥物劑量調(diào)整無顯著相關(guān)性(χ2=0.051,P=0.822)。

討 論

Peg-IFN是HCV或HBV抗病毒治療重要的藥物之一，其在CHC患者和優(yōu)勢的CHB人群具有良好的療效[5-7]，但其不良反應(yīng)明顯限制了其臨床應(yīng)用，主要不良反應(yīng)包括骨髓抑制所致的血細(xì)胞減少癥(中性粒細(xì)胞和血小板)、精神異常、自身免疫性疾病和視網(wǎng)膜病變等疾病[8-9]，其中Peg-IFN所致血小板減少癥是其常見的不良反應(yīng)之一，常導(dǎo)致抗病毒治療過程中藥物的減量或停藥，是影響抗病毒療效的重要原因。既往的研究表明，宿主SNP與Peg-IFN的藥物不良反應(yīng)相關(guān)[10-11]，但上述研究主要在國外CHC患者中報道，不同人種SNP的差異很大，國內(nèi)外SNP與疾病狀態(tài)的相關(guān)性可能并不一致，CHC宿主SNP與Peg-IFN所致血小板減少癥的相關(guān)性在國內(nèi)未見相關(guān)報道。另外，Peg-IFN所致血細(xì)胞減少癥的主要機制與骨髓抑制有關(guān)，理論上與不同的慢性肝炎病毒感染的相關(guān)性不大，但國內(nèi)外對CHB患者宿主SNP與Peg-IFN抗病毒治療所致的血小板減少癥相關(guān)性未見報道。

本研究納入本院既往使用Peg-IFN/RBV抗病毒治療的CHC和Peg-IFN抗病毒治療的CHB患者進(jìn)行研究，結(jié)果提示在CHC患者，ITPA基因rs1127354位點AA/AC型Peg-IFN/RBV治療后4周和8周血小板下降程度顯著高于CC型患者，但在CHB患者中，ITPA基因rs1127354位點AA/AC型和CC型在Peg-IFN抗病毒治療后各時間點血小板下降程度無顯著相關(guān)性。另外，CHC患者ITPA基因rs1127354位點AA/AC型抗病毒治療過程中Peg-IFN藥物劑量減量的構(gòu)成比顯著高于CC型，但CHB患者rs1127354位點SNP與Peg-IFN抗病毒治療過程中藥物劑量減量的構(gòu)成比無顯著差異。

既往國外學(xué)者的研究已表明，ITPA基因rs1127354位點SNP與Peg-IFN/RBV抗病毒治療過程中RBV所致的溶血性貧血相關(guān)，其中CC型患者血紅蛋白下降程度更顯著[4, 12-13]，且上述研究也發(fā)現(xiàn)，rs1127354位點SNP與Peg-IFN誘導(dǎo)的血小板減少癥顯著相關(guān)。本研究的結(jié)果也提示在國內(nèi)CHC使用Peg-IFN/RBV抗病毒治療的患者中，rs1127354位點SNP與Peg-IFN誘導(dǎo)的血小板減少程度顯著相關(guān)，但該SNP位點與CHB使用Peg-IFN抗病毒治療所致的血小板減少癥無明顯相關(guān)性。其原因可能在于rs1127354位點CC型的CHC患者由于血紅蛋白下降更明顯，促使紅細(xì)胞生成素(EPO)的水平升高，而EPO和促血小板生成素(TPO)的氨基酸序列具有部分同源性，因此EPO有可能也作用于巨核細(xì)胞，從而促進(jìn)血小板生成，由此代償性減輕CC型患者Peg-IFN所致血小板減少癥[14-15]，AA/CC患者血小板下降程度高于CC型患者的機制可能與此有關(guān)。另外，血小板下降水平僅在4周和8周有差異，可能與治療過程中不同患者SNP與藥物減量機會的差異有關(guān)。在CHB患者，由于僅使用Peg-IFN單藥進(jìn)行抗病毒治療，對血紅蛋白的濃度無顯著影響。因此，rs1127354位點SNP與CHB患者Peg-IFN抗病毒治療所致血小板減少癥無顯著相關(guān)性的原因可能與此相關(guān)。

綜上所述，CHC患者rs1127354位點SNP與Peg-IFN抗病毒治療所致血小板減少癥顯著相關(guān)，但CHB患者rs1127354位點SNP與其無顯著相關(guān)性。Peg-IFN目前仍然是CHB抗病毒治療的重要藥物，雖本研究暫未發(fā)現(xiàn)CHB患者rs1127354位點SNP與Peg-IFN抗病毒治療所致血小板減少癥有關(guān)，但對了解Peg-IFN治療的毒副作用機制，指導(dǎo)患者的個體化治療，從而減少藥物的不良反應(yīng)，并提高用藥安全性有重要的意義。因此，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)一步研究，尋找相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。