靶向肝X受體對PD-1單抗治療原發性肝癌的增敏作用

周宇，張偉偉，高悠婷

溫州醫科大學附屬第三醫院 感染科，浙江 溫州 325200

原發性肝癌是世界上最常見、惡性度最高的腫瘤之一，其發病率和病死率分別位于各類腫瘤第六位以及第四位[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是肝癌最主要的組織類型，占70%～85%[2]。轉移和復發是制約HCC治療效果、影響患者預后的重要因素[3]。近年來，臨床數據顯示以程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1, PD-L1）單抗為代表的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已在包括HCC在內的多種惡性腫瘤中取得了良好的治療效果[4]。然而，目前PD-1單藥治療的反應率（客觀緩解率）為15%～20%[5]，亟需在探索PD-1單抗治療的耐藥性的基礎上，尋找新的聯合手段，以進一步提高ICIs治療原發性肝癌的療效。

肝臟X受體（hepatic X receptor, LXR）是核受體家族的重要成員之一，主要參與調控膽固醇、脂肪酸和糖代謝等生理過程，存在α和β兩種亞型[6]。研究表明，激活LXR能顯著抑制肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤等多種惡性腫瘤生長[7-13]。 邵衛清等[14]在肝癌中還發現LXR特異性激動劑T0901317（以下簡稱T09）能通過調控膽固醇代謝，提高肝癌細胞對多種靶向藥物包括索拉非尼、瑞格非尼的敏感性。然而，到目前為止，關于LXR受體及其激動劑在調控肝癌免疫逃逸及ICIs療效方面的作用尚不明確。本研究通過臨床樣本、細胞實驗和在體動物模型實驗，全面探討LXR與肝癌細胞PD-L1表達的相關性，在此基礎上進一步探討LXR激動劑T09對PD-1單抗協同治療的增效作用，旨在為肝癌免疫治療提供新的增敏靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌細胞系MHCC-97H由復旦大學腫瘤轉移研究所饋贈。小鼠肝癌細胞系Hepa1-6購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。所有細胞系均在37 ℃、5% CO2環境 下，在添加10% FBS的高糖DMEM中培養。16只雄性、4周齡C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，體質量約20 g。

LXR激動劑T0901317購自美國Selleck公司，DMEM高糖培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，PD-1單抗購自吉滿生物科技公司。LXR、PD-L1免疫組化單克隆抗體分別購自美國Abcam和Proteintech公司。相關基因引物由上海杰李生物技術有限公司設計并合成。

20例HCC患者的腫瘤石蠟標本（包含腫瘤組織和癌旁正常肝組織）收集自瑞安市人民醫院，均接受手術切除，由病理證實為HCC，且均未接受任何術前治療。本研究通過瑞安市人民醫院倫理學審查（批件號：M20190003）。

1.2 方法

1.2 .1 相關性分析：利用網頁工具GEPIA分析TCGA數據庫中肝癌組織LXR、ABCA1表達水平和PD-L1表達水平的相關性。

1.2 .2 免疫組織化學染色：取石蠟切片，采用 Novolink聚合物檢測系統（德國萊卡公司）的兩步方案進行免疫組織化學染色。樣本常規脫蠟水化后，采用高壓修復方式修復抗原，用過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶的活性。非免疫性動物血清封閉后，切片在4 ℃下與一抗（兔抗人PD-L1，濃度1:400；鼠抗人LXR，濃度1:200）孵育過夜，在37 ℃下與二抗孵育30 min。DAB染色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯固定，放置在蓋玻片下。將染色強度和陽性細胞百分比納入半定量評分，LXR評分標準：0分，陽性細胞數＜5%；1分，陽性細胞數5%～25%；2分，陽性細胞數26%～50%；3分，陽性細胞數50%以上；0～1分定義為陰性，2～3分定義為陽性。PD-L1評分標準：0分，陽性細胞數＜1%；1分，陽性細胞數2%～5%；2分，陽性細胞數5%～10%；3分，陽性細胞數大于10%；0～1分定義為陰性，2～3定義為陽性。

1.2 .3 細胞培養：將MHCC-97H、Hepa1-6細胞置于含10%胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中連續培養。細胞密度達90%時，采用0.25%的胰蛋白酶進行消化并傳代。

1.2.4 慢病毒介導的RNA干擾：所有shRNA構建均來自Sigma-Aldrich。將C末端標記的AMFR克隆到pCDH中，獲得AMFR過表達質粒。所有質粒均經測序驗證。取對數生長期，密度60%～80%的HEK-293T細胞包裝病毒，48 h后收取HEK-293T細胞培養上清液，3 000 r/min離心10 min，使用0.45 μm濾膜過濾后，即為含病毒上清液，-80 ℃保存。將 Hepa1-6細胞提前1 d接種于60 mm細胞培養皿中。第2天，細胞密度為20%～30%，棄去培養基后加入1 mL制備好的病毒上清液和2 mL新鮮培養基，同時加入3 μL（1 000×）Polybrene，感染18～24 h后換成新鮮的DMEM完全培養基。48 h和72 h分別使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞熒光狀態，當＞80%細胞發出熒光時，加入puromycin（終濃度2 μg/mL）篩選。

1.2 .5 蛋白質印跡（Western blot）法檢測：在細胞裂解緩沖液中收集細胞，煮沸15 min。使用BCA蛋白質檢測試劑盒對蛋白質濃度進行定量。所有蛋白質在8%～12% SDS-PAGE上分離。以β-肌動蛋白（Actin）作為內對照。

1.2 .6 小鼠皮下瘤移植干預實驗：取C57BL/6小鼠，在潔凈條件下的層流柜中飼養。將Hepa1-6細胞（1×107）接種于小鼠右側皮下。當形成可觸及的腫瘤時，將小鼠隨機分為4組（每組4只），分別為對照組（PBS每隔1 d灌胃）、T09組（30 μg/g，每隔1 d 灌胃）[14]、PD-1單抗組（每3 d腹腔注射100 μg）、PD-1單抗+T09組（劑量同單藥組），3周后處死小鼠測量皮下腫瘤體積。

1.3 統計學處理方法 應用Graphpad Prism 6.0統計軟件進行分析。計量資料使用±s表示，采用t檢驗；計數資料使用例數表示，采用Fisher檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫中肝癌組織PD-L1和LXR、ABCA1表達水平的相關性 利用網頁工具GEPIA分析TCGA數據庫中肝癌組織LXR及其下游靶基因ABCA1表達水平和PD-L1表達水平的相關性，結果顯示，在肝癌組織中，ABCA1表達水平與PD-L1表達水平呈正相關 （r=0.12，P=0.021），LXR表達水平與PD-L1表達水平也呈正相關（r=0.20，P＜0.001），見圖1。

圖1 生物信息數據庫分析LXR及其下游基因ABCA1表達和PD-L1表達的相關性

2.2 肝癌組織中PD-L1和LXR表達情況及兩者的相關性 免疫組化結果顯示，LXR作為細胞核受體，特征性表達于細胞核中，而PD-1主要表達于細胞漿和細胞膜。高表達LXR的患者往往合并PD-L1高表達，20例肝癌腫瘤組織中，兩者均為陽性表達的有7例，均為陰性表達的共8例，免疫組化統計結果顯示，兩者表達具有相關性，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2、表1）。

表1 肝癌組織中LXR和PD-L1表達的相關性分析

圖2 代表性病例4和19免疫組化染色結果

2.3 細胞體外敲除LXR對PD-L1表達的影響 在體外運用人肝癌細胞系MHCC-97H，通過慢病毒介導的RNA干擾技術，穩定降低細胞中LXR的表達，分析敲除后細胞中PD-L1的表達變化，Western blot結果顯示，和對照細胞系相比，兩條干擾（序列LXR-sh1和LXR-sh2）均能顯著降低肝癌細胞內LXR的表達水平，PD-L1的表達水平亦顯著下調，見圖3。

圖3 LXR敲除對PD-L1表達的影響

2.4 聯合LXR激動劑T09和PD-1單抗對Hepa1-6小鼠模型皮下腫瘤生長的影響 對照組腫瘤體積為（2 540.0±348.7）mm3，PD-1單抗+T09組小鼠皮下瘤體積為（217.2±66.3）mm3，差異有統計學意義（t=6.543，P＜0.001）。PD-1單抗組腫瘤體積為（1 430.0±134.1）mm3，與PD-1單抗+T09組相比，差異有統計學意義（t=8.106，P＜0.01），見圖4，說明LXR激動劑T09可增強體內PD-1單抗的抗腫瘤作用。

圖4 免疫健全小鼠體內試驗評價LXR激動劑T09聯合PD-1單抗治療肝癌的效果

3 討論

LXR于1994年作為核受體家族的重要成員被發現[13]，曾一度被認為是孤核受體。隨著JANOWSHI等[15]報道羥固醇可內源性激活LXR以來，其生理功能才被逐步認識。目前已經發現，LXR主要參與調控膽固醇、脂肪酸等多種生理代謝過程[6，16]。近年來發現，LXR與多種惡性腫瘤有關，被認為是藥物治療靶點之一[17-19]。

膽固醇作為真核細胞至關重要的脂質分子，既可作為前體合成類固醇激素、膽汁酸等，又可作為細胞膜的組成部分調控多種跨膜信號通路[20-22]。研究表明，腫瘤細胞膽固醇累積可通過激活多種促癌信號通路促進腫瘤的發生、生長和轉移[23-27]。SHAO等[25]在肝癌研究中發現，激活LXR可調控膽固醇代謝水平，進而抑制表皮生長因子受體及其下游信號通路，從而發揮抗腫瘤作用。

PD-L1是腫瘤細胞膜表面除RTKs外的又一重要的細胞膜蛋白，其作為主要的ICIs，可介導腫瘤免疫逃逸[28]。最近的一項研究表明，膽固醇積累通過上調包括PD1在內的各種免疫檢查點蛋白表達，導致T細胞衰竭[29]。然而膽固醇代謝如何維持PD-1/PD-L1信號途徑，進而介導腫瘤免疫逃逸仍不清楚。本研究發現，作為膽固醇代謝途徑的調控核受體，LXR和肝癌細胞PD-L1表達高度正相關，抑制LXR表達可顯著下調細胞內PD-L1表達水平，提示LXR可能通過調控PD-L1水平介導肝癌免疫逃逸。

PD-1單抗進入臨床應用以來，已經在肝癌中展現了初步的治療效果。臨床研究表明，單獨或聯合使用PD-1單抗可作為晚期肝癌的一線治療藥物[29]。 然而，數據表明，在肝癌中單藥使用PD-1的效果仍不理想，客觀緩解率僅15%左右[5]。因此，尋找PD-1單抗有效的預測靶點和潛在增敏藥物意義重大。本研究發現，LXR的激動劑T09可在小鼠體內大大改善PD-1抗肝癌治療的療效。

綜上，本研究在肝癌臨床樣本中發現LXR和PD-L1表達相關的基礎上，進一步通過小鼠體內實驗明確了LXR激動劑聯合PD-1單抗治療能顯著增加PD-1治療肝癌的療效，為肝癌免疫治療提供了新的代謝增敏靶點。