miRNA-1在大鼠心搏驟停心肺復蘇后心肌焦亡及損傷中的作用

殷佳娜，李炳燦，周培森，雷遠麗，王東升，許華清，宋文興，何愛文，李章平

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 急診科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 急診科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學附屬衢州醫院 衢州市人民醫院 急診科，浙江 衢州 324000

心搏驟停（cardiac arrest, CA）是臨床危急重癥，心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation,CPR）是對CA后患者所實施的一種緊急搶救措施。據統計，我國院外心臟驟停（out-of-hospital cardiac arrest, OHCA）后的存活出院率低于1%[1]。CA/CPR是全身缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）的過程，CA/CPR后出現的不同程度的心腦功能障礙是自主循環恢復（return of spontaneous circulation, ROSC）后患者死亡的主要原因，其病理生理機制復雜。深入闡明其機制，在ROSC后患者的治療中，對于提高患者預后具有極為重要的價值[2]。

細胞焦亡（pyroptosis）是一種特殊的程序性細胞死亡（programmed cell death, PCD），它在本質上是細胞發生的炎癥性壞死，主要形態學特征是細胞水腫、崩解、胞膜小孔形成，并伴隨釋放大量的炎癥因子[3]。LIU等[4]和LOU等[5]研究發現細胞焦亡在心肌IRI后發揮著重要作用。但CA/CPR患者ROSC后的心肌細胞焦亡情況尚不清楚。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種長度為18～22個核苷酸的非編碼小RNA分子，可調控30%以上人類基因表達[6]。其中，miR-1是肌肉組織特異性表達miRNA，占所有成年人心臟miRNA的40%[7]，是參與心肌損傷過程的一種重要miRNA[8]。但在CA/CPR后心肌功能障礙形成中，miR-1的變化和作用尚未明確，其和細胞焦亡的關系也有待研究。本研究通過建立大鼠窒息型CA/CPR模型，觀察ROSC后心肌細胞焦亡和損傷變化，并探討miR-1在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 RNA提取試劑TRIzol（美國Invitrogen公司），cDNA反轉錄試劑盒（美國Thermo公司），SYBR Green試劑盒（上海Toroivd公司）。miR-1抑制劑（antago miR-1）、miR-1模擬物（ago miR-1）、miR抑制劑陰性對照物（antago miR NC）、miR模擬物陰性對照物（ago miR NC）均訂購自廣州銳博生物技術有限公司，TUNEL染色試劑盒（英國Roche公司），核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3NOD（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）抗體、 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白1（Caspase-1）抗體、白介素-1β（interleukine-1 beta, IL-1β）抗體、白介素-18（interleukine-18, IL-18）抗體（美國Proteintech公司），大鼠肌肉B型肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme muscle B, CK-MB）、 心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）ELISA試劑盒（上海博蘊生物公司）。實時熒光定量PCR儀、Gel DocTM XR+自動曝光機（美國伯樂公司），小型動物呼吸機RWD407（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 大鼠窒息型CA/CPR模型建立 SPF級成年雄性SD大鼠，體質量250～300 g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2021-0017，飼養和實驗遵守溫州醫科大學實驗動物中心管理和使用規定，并遵守中國實驗動物管理條例。實驗前自由飲水，禁食12 h。參照TIAN等[9]、QIN等[10]的方法建立CA/CPR模型。腹腔注射2%戊巴比妥鈉 3 mL/kg麻醉下，保定，頸部正中切口，分離右側頸內動脈置管，接壓力換能器行血壓監測，記錄基礎平均動脈壓（mean arterial pressure, MAP）。分離氣管，切開后插管；暴露頸靜脈建立靜脈通路。待大鼠血壓和心率穩定后，CA/CPR組在大鼠呼氣末夾閉氣管導管制備CA/CPR模型。CA后5 min時開始純氧機械通氣（頻率70次/min，潮氣量6 mL/kg），同時進行人工胸外心臟按壓，按壓頻率為150～180次/min， 深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，同時經頸靜脈注射腎上腺素0.02 mg/kg，直至恢復ROSC時停止按壓。CA判斷標準為心電圖呈室顫、停搏或無脈性電活動，收縮壓≤25 mm Hg（1 mmHg=0.133 kPa）。ROSC判斷標準為心電圖出現自主節律，收縮壓＞60 mm Hg， 并持續10 min以上。所有大鼠在ROSC后6 h取心尖部心肌組織、血樣待測。

1.3 實驗分組及干預 36只大鼠按照隨機數字表法被均分為6組，干預劑注射方法均參照BIAN等[11]的研究方法：①假手術對照（Sham）組：僅實施麻醉、組織血管分離、插管等手術操作，未進行窒息性操作。②心搏驟停復蘇（CA）組：使用窒息法構建 窒息型CA/CPR模型。③CA+miR-1抑制劑（CA+antago miR-1）組：術前3 d通過尾靜脈注射200 pmol（/kg·d） antago miR-1，連續注射3 d，進行窒息型CA操作。④CA+miR抑制劑陰性對照（CA+antago miR NC）組：在與CA+antago miR-1組同一時間點，注射等劑量antago miR NC，進行窒息型CA操作。⑤CA+miR-1模擬物（CA+ago miR-1）組：術前3 d通過尾靜脈通路注射100 pmol（/kg·d） ago miR-1，連續注射3 d， 進行窒息型CA操作。⑥CA+miR模擬物陰性對照（CA+ ago miR NC）組：在與CA+ago miR-1組同一時間點，注射等劑量ago miR NC，進行窒息型CA操作。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative poly-merase chain reaction, qPCR）檢測細胞miRNA-1水平 按照RNA提取試劑TRIzol的說明書進行操作，提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。反轉錄合成cDNA后進行Real-time PCR檢測，以U6作內參。PCR擴增條件為： 95 ℃預變性15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個循環。使用的引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，序列如下：miR-1 F 5’-GCGCGTGGAATGTAA AGAAGT-3’；miR-1 R 5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’； U6 F 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6 R 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。以Sham組表達量為 1，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量。

1.5 TUNEL法檢測心肌細胞焦亡率 參照陳穎 等[12]的研究方法，使用TUNEL染色法檢測細胞焦亡率。按照試劑盒使用說明書，將各組心肌組織取出后，用4%多聚甲醛固定，進行脫水、包埋、切片，枸櫞酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）清洗2次，加入含0.2% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min，PBS清洗2次，加入TUNEL檢測液，37 ℃ 避光孵育60 min，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）復染樣品，正置熒光顯微鏡成像。對每個視野下TUNEL陽性細胞進行計數，統計得出各組細胞焦亡率（焦亡率= TUNEL陽性細胞數/視野細胞核總數）。

1.6 蛋白質印跡（Western blot）檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達 提取細胞總蛋白，用BCA法定量。細胞蛋白經凝膠電泳、電轉移和緩沖液封閉后，加入一抗NLRP3（1:500）、GAPDH（1:1 000）、Caspase-1（1:1 000）、IL-18（1:1 000）或IL-1β（1:1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗（1:500）常溫孵育2 h。再次洗膜后，加入1 mL 電化學發光液與膜充分接觸，于成像系統進行圖像采集。以Sham組默認為1比較，實驗組/對照組的蛋白條帶吸光度（absorbance, A）值相對比值表示目的蛋白的表達量。

1.7 酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清CK-MB、cTnI含量 采用尾部斷尾采血方法采集外周血。采集的血液，先放在37 ℃培養箱溫浴1 h，4 ℃冰箱過夜；取出以3 000 r/min離心15 min分離出血清。采用ELISA測定大鼠血清CK-MB、cTnI的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、基礎MAP的比較 各組大鼠體質量、基礎MAP差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量、基礎MAP水平比較（每組n=6，±s）

表1 各組大鼠體質量、基礎MAP水平比較（每組n=6，±s）

組別 體質量（g） 基礎MAP（mmHg）Sham組 276.0±14.0 111.7±5.6 CA組 271.5±12.1 110.2±3.3 CA+antago miR-1組 280.3± 9.4 111.3±4.2 CA+ago miR-1組 272.3± 8.3 111.8±6.3 CA+antago miR NC組 278.3±11.9 111.2±7.6 CA+ago miR NC組 270.8±14.7 108.3±5.6 F 2.250 0.353 P 0.145 0.749

2.2 各組大鼠心肌miRNA-1水平比較 各組大鼠心肌miRNA-1水平差異有統計學意義（F=207.2，P＜ 0.01）。兩兩比較發現，與Sham組比，CA組、CA+ antago miR-1組、CA+ago miR-1組、CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌miR-1表達均有升高（均P＜0.01）。與CA組比，CA+antago miR-1組大鼠心肌miR-1表達降低（P＜0.01），CA+ago miR-1組大鼠心肌miR-1表達升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織miRNA-1表達量

2.3 各組大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白表達的比較 與CA組比，CA+antago miR-1組大鼠心肌焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達降低 （P＜0.05），CA+ago miR-1組大鼠心肌焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白表達的比較

2.4 各組大鼠心肌細胞焦亡率的比較 經TUNEL法檢測，與CA組比較，CA+antago miR-1組大鼠心肌焦亡率降低（P＜0.01），CA+ago miR-1組大鼠心肌焦亡率升高（P＜0.01），CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌焦亡率差異無統計學意義（P＞ 0.05），見圖3、圖4。

圖4 各組大鼠心肌細胞焦亡率的比較

2.5 各組大鼠CA/CPR后血清中CK-MB、cTnI水平變化 經ELISA法檢測，與CA組比較，CA+antago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平降低（均P＜0.05），CA+ago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平升高（P＜0.01），CA+antago miR NC組、CA+ago miR NC組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠CA/CPR后血清中CK-MB、cTnI水平

3 討論

miR-1作為肌肉組織特異性表達miRNA，在肌肉及心肌組織中具有重要作用，JAYAWARDENA等[13]研究表明，miR-1在心肌細胞缺血再灌注損傷時發生的凋亡中發揮顯著作用。ZHOU等[14]的研究表明，miR-1通過改變Bax和Bcl-2影響心肌細胞凋亡進而對心肌損傷具有促進作用，即抑制miR-1可減輕心肌損傷。細胞凋亡與細胞焦亡都屬于程序性細胞死亡，細胞凋亡是經典的PCD模式，它的主要特征是細胞皺縮以及凋亡小體的形成[15]；而細胞焦亡由外源性感染導致的，它的特征是會釋放出IL-1β和其他小分子物質，從而導致發生炎癥反應[16]。

本研究根據以往心肺復蘇后心肌損傷的不同時間點變化，選取大鼠CA/CPR ROSC后心肌損傷的高峰時間點，即ROSC后6 h為觀察點，比較Sham組、CA組、CA+ago miR-1組和CA+antago miR-1組的心肌細胞miR-1表達，發現CA組、CA+ago miR-1組和CA+antago miR-1組miR-1表達均顯著高于Sham組，加用ago miR-1后比CA組miR-1表達顯著增高，加用antago miR-1后比CA組miR-1表達顯著降低，而兩個NC組和CA組miR-1表達無差別，提示在大鼠CA/CPR模型中，靜脈通路加用ago miR-1可以促進心肌細胞miR-1的表達，靜脈通路加用antago miR-1可以減少心肌細胞miR-1的表達，也說明可以使用靜脈通路加用ago miR-1或antago miR-1來調節心肌細胞miR-1的表達從而觀察miR-1對相關指標的影響。

CK-MB和cTnI均是常用的心肌損傷標志物，廣泛應用于臨床診斷多年[17]。與CK-MB相比，cTnI在診斷心肌損傷中敏感性和特異性更高[18]。研究發現，在CA/CPR動物模型及患者身上，血清中CK-MB、cTnI都明顯升高，提示出現了明顯的心肌損傷[19-20]。 本研究發現，與Sham組比較，CA組大鼠ROSC后6 h血清CK-MB和cTnI均明顯升高，提示存在心肌損傷，和上述他人研究結果一致。本研究進一步使用靜脈通路加用ago miR-1或antago miR-1來調節心肌細胞miR-1的表達發現，與CA組相比，CA+antago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平有統計學意義的降低，而CA+ago miR-1組大鼠心肌CK-MB、cTnI水平有統計學意義的升高，但還是均高于對照組，提示調節心肌miR-1可以調控心肌損傷，表明miR-1促進了CA/CPR后的心肌損傷，減少CA/CPR后心肌miR-1的表達具有心臟保護作用。

研究發現[21-22]，細胞焦亡與許多心肌疾病、動脈粥樣硬化以及各種導致器官功能障礙的疾病有著十分密切的關系。焦亡的經典途徑在于活化的NLRP3 與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）寡聚形成ASC斑點。pro-Caspase-1在形成的ASC斑點誘導作用下，將被切割后變為成熟的Caspase-1，而Caspase-1又對pro-IL-1β、pro-IL-18進行分裂作用，使其形成成熟的IL-1β、IL-18并釋放到細胞外[23-24]。因此，焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和直接用TUNEL法檢測細胞焦亡率均可作為觀測焦亡水平的指標。心肺復蘇后心肌細胞焦亡情況目前少有研究，本研究發現，與Sham組比較，CA組大鼠ROSC后6 h心肌細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率均明顯增加，提示CA/CPR后存在明顯的細胞焦亡的現象。進一步與CA組比較，靜脈加用ago miR-1促使心肌miR-1表達后，CA+ago miR-1組大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率更是明顯增加，靜脈使用antago miR-1抑制心肌細胞miR-1表達后，CA+antago miR-1組大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β和焦亡率明顯減少，提示改變CA/CPR后心肌miR-1表達可調節心肌細胞焦亡水平，過表達miR-1會加劇心肌焦亡，減少miR-1表達則可抑制心肌焦亡，結合細胞焦亡必然引起組織損傷，提示CA/CPR后心肌miR-1表達促進心肌損傷可能是通過促進細胞焦亡的途徑。

綜上所述，靜脈使用ago miR-1和antago miR-1可以調節CA/CPR后大鼠心肌細胞miR-1的表達，進而可促進或減少心肌損傷，其機制可能和miR-1調節心肌細胞焦亡有關，抑制CA/CPR后心肌細胞的miR-1表達，可降低心肌細胞的焦亡水平，進而保護心肌細胞，是潛在的治療靶點。